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1. 媒体准备
注意:将所有媒体加热到37 °C 在用于细胞培养之前。
- 小鼠胚胎成纤维细胞 （MEF） 培养基（用于制备 500 mL）
- 将 50 mL 胎牛血清 （FBS） 添加到 449 mL Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 中，并通过 500 mL 0.22 μm 孔径过滤器单元过滤。
- 过滤后加入 1 mL 抗菌剂 （50 mg/mL）。将培养基在 4 °C 下储存长达 1 个月，或分装并储存在 ≤ -20 °C。
- N2 填料（用于制备 500 mL）
- 将 5 mL L-丙氨酸-L-谷氨酰胺 （100x） 和 500 μL 2-巯基乙醇 （55 mM） 添加到 489.5 mL DMEM:营养混合物 F-12 （DMEM/F-12） 中，并通过 500 mL 0.22 μm 孔径过滤器单元过滤。
- 过滤后加入 1 mL 抗菌剂 （50 mg/mL） 和 5 mL N2 补充剂-B。将培养基在 4 °C 下避光储存长达 1 个月。
- 无血清生长培养基 （KSR）（用于制备 500 mL）
- 将 75 mL 无血清培养基补充剂、5 mL L-谷氨酰胺 （100x）、5 mL MEM 非必需氨基酸 （MEM-NEAA） （100x） 和 500 μL 2-巯基乙醇 （55 mM） 添加到 413.5 mL 不含谷氨酰胺的非谷氨酰胺中，并通过 500 mL 0.22 μm 孔径过滤器单元过滤。
- 过滤后加入 1 mL 抗菌剂 （50 mg/mL）。将培养基在 4 °C 下储存长达 1 个月。
- 小鼠胚胎干细胞培养基（用于制备 500 mL）
- 将 75 mL 干细胞级 FBS、5 mL MEM-NEAA （100x）、5 mL L-谷氨酰胺 （100x） 和 500 μL 2-巯基乙醇 （55 mM） 添加到 413.5 mL 含 DMEM 的非谷氨酰胺中，并通过 500 mL 0.22 μm 孔径过滤器单元过滤。
- 过滤后加入 1 mL 抗菌剂 （50 mg/mL）。将培养基在 4 °C 下避光储存长达 1 个月，或分装并储存在 ≤ -20 °C。
2. 培养 mESC
- 将 MEF 培养基中有丝分裂失活的 MEF 饲养层细胞以 3-4 x 104 个细胞/cm2 的浓度接种到经组织培养处理的平板上。在铺板 mESC 之前，让它们在 37 °C、≥ 95% 相对湿度和 5% CO2 的细胞培养箱中沉淀至少 12 小时。如果未立即使用，请每 3 天更换一次 MEF 介质。如果在铺板后 7 天内未使用 MEF，请丢弃。
- 将 mESC（密度范围为 1-4 x 104 个细胞/cm2）添加到含有小鼠白血病抑制因子 （mLIF） （1,000 U/mL） 的 mESC 培养基中的 MEF 板中。将细胞在 37 °C 下≥ 95% 相对湿度和 5% CO2 下孵育。
- 一旦培养皿变得 ~ 70-80% 汇合或菌落开始接触，使用胰蛋白酶-EDTA（0.05% 胰蛋白酶）（1:5-1:10） 传代 mESC。这通常每 2 天进行一次，但也可能需要 4 或 5 天，具体取决于初始电镀密度。
- 将 mESC 维持在 mESC 培养基中的 MEF 饲养层上，以保持多能性。
- 在开始分化之前，将细胞至少传代一次到不含 MEF 的明胶包被平板上，以稀释 MEF。
- 通过在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中加入 0.1% 明胶和Ca2 + / Mg2 + 添加到组织培养处理的培养皿中，并在37°C下放置至少1小时来制备明胶涂层板。板1.5-2 x 106个细胞/ 10 cm板（2.7-3.6 x 104个细胞/ cm2），并让细胞扩增2天，然后开始分化。
3. 将 mESC 区分为 MGE 样端脑祖
细胞
- 分化日 （DD） 0 ="浮细胞"
- mESC 在明胶包被板上生长 2 天后，吸出培养基并用不含 Ca2+/Mg2+ 的 PBS 洗涤细胞一次。添加足够的胰蛋白酶-EDTA（0.05% 胰蛋白酶）以覆盖板表面（通常一个 10 cm 组织培养皿使用 4 mL 胰蛋白酶-EDTA），并将细胞放回 37 °C 的培养箱中≥95% 相对湿度和 5% CO2 4 分钟。
- 4 分钟后，用 2 倍体积的 mESC 培养基淬灭胰蛋白酶-EDTA。将细胞转移到适当大小的离心管中，并以 200 x g 的速度离心细胞 5 分钟。5 分钟后，取出试管并吸出培养基，而不会干扰沉淀。将沉淀重悬于含有 BMP 抑制剂 LDN-193189 （250 nM） 和 Wnt 抑制剂 XAV-939 （10 μM） 的 1 mL KSR:N2 培养基 （1:1） 中。
- 使用血细胞计数器或自动细胞计数仪测量细胞浓度。在非贴壁组织培养皿中加入含有 LDN-193189 （250 nM） 和 XAV-939 （10 μM） 的 KSR:N2 培养基 （1:1），以 75,000 个细胞/mL 的比例开始培养细胞为胚状体 （EB）。将细胞在 37 °C 下≥ 95% 相对湿度和 5% CO2 下孵育。
- 在 DD1 上，通过在 37°C、≥ 95% 相对湿度下用聚-L-赖氨酸（10 μg/mL，含 Ca2+/Mg2+的 PBS）包被组织培养处理的培养皿过夜 （O/N） 或至少 1 小时，为细胞"登陆"做准备。
- 在 DD2 上，吸出聚-L-赖氨酸，并在 37 °C 下用层粘连蛋白（10 μg/mL，含 Ca2+/Mg2+）O/N 包被板≥相对湿度><为 95%。
注意:虽然 O/N 是最佳的，但短至 2 小时可能就足够了。如果第二天未使用平板，吸出层粘连蛋白，用不含 Ca2+/Mg2+ 的 PBS 替换，并在 4 °C 下储存长达 2 周。
- DD3 （"陆地细胞"）
- 在开始 EB 解离之前，吸出层粘连蛋白并让板在组织培养罩中完全干燥。不要使用看起来有光泽或明显潮湿的印版。将含培养基的 EB 转移到 15 mL 试管中，以 15 x g 的离心速度离心 3-4 分钟，或直到 EB 沉淀。
- 吸出培养基，加入 3 mL 含有 DNase （2 U/mL） 的细胞分离溶液，并在 37 °C 下≥ 95% 相对湿度和 5% CO2 孵育 15 分钟。每 3 分钟轻轻弹动试管以帮助 EB 解离。
- 一旦 EB 不再可见或已过 15 分钟，加入 6 mL 含有 DNase （1 U/mL） 的 KSR:N2 （1:1），并以 200 x g 离心 5 分钟。
- 将细胞接种在含有 LDN-193189 （250 nM）、XAV-939 （10 μM） 和 ROCK 抑制剂 Y-27632 （10 μM） 的 KSR:N2 （1:1） 中，浓度为 4.5-5 x 104 个细胞/cm2。