从小鼠胚胎干细胞生成皮层中间神经元前体细胞

摘要

来源：Tischfield, D. J.，等 小鼠胚胎干细胞向皮层中间神经元前体细胞的分化。J. Vis. Exp. (2017)

本视频介绍了一种从小鼠胚胎干细胞生成皮层中间神经元前体细胞的方法。该方案包括在含有特定小分子抑制剂的培养基中培养干细胞，以促进干细胞的增殖并聚集形成拟胚体（EB）。随后，使用酶消化法将拟胚体解离，并接种至包被有黏附蛋白的培养板孔中，以促进其向皮层中间神经元前体细胞分化。

方案

1. 培养基制备

注意：在细胞培养中使用前，将所有培养基预热至 37 °C。

1. 小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）培养基（配制 500 mL）
   1. 向 449 mL 达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）中加入 50 mL 胎牛血清（FBS），并通过 500 mL 0.22 µm 孔径滤器过滤。
   2. 过滤后加入 1 mL 抗微生物剂（50 mg/mL）。将培养基在 4 °C 保存，最多可保存 1 个月；或分装后于 ≤ -20 °C 保存。
2. N2 培养基（配制 500 mL）
   1. 向 489.5 mL DMEM/F-12 培养基（DMEM:营养混合物 F-12）中加入 5 mL L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（100x）和 500 µL 2-巯基乙醇（55 mM），并通过 500 mL 0.22 µm 孔径滤器过滤。
   2. 过滤后加入 1 mL 抗微生物剂（50 mg/mL）和 5 mL N2 supplement-B。将培养基避光保存于 4 °C，最多可保存 1 个月。
3. 无血清生长培养基（KSR）（配制 500 mL）
   1. 向 413.5 mL 不含谷氨酰胺的 DMEM 中加入 75 mL 无血清培养基添加剂、5 mL L-谷氨酰胺（100x）、5 mL MEM 非必需氨基酸（MEM-NEAA）（100x）和 500 µL 2-巯基乙醇（55 mM），并通过 500 mL 0.22 µm 孔径滤器过滤。
   2. 过滤后加入 1 mL 抗微生物剂（50 mg/mL）。将培养基在 4 °C 保存，最多可保存 1 个月。
4. 小鼠胚胎干细胞培养基（配制 500 mL）
   1. 向 413.5 mL 不含谷氨酰胺的 DMEM 中加入 75 mL 干细胞级胎牛血清（FBS）、5 mL MEM-NEAA（100x）、5 mL L-谷氨酰胺（100x）和 500 µL 2-巯基乙醇（55 mM），并通过 500 mL 0.22 µm 孔径滤器过滤。
   2. 过滤后加入 1 mL 抗微生物剂（50 mg/mL）。将培养基避光保存于 4 °C，最多可保存 1 个月；或分装后于 ≤ -20 °C 保存。

2. 培养小鼠胚胎干细胞（mESCs）

1. 将有丝分裂非活跃的MEF饲养细胞以3-4 × 10⁴ 个细胞/cm² 的密度接种于经组织培养处理的培养板中，并加入MEF培养基。在接种mESCs前，于37 °C、相对湿度≥95%、5% CO₂ 的细胞培养箱中孵育至少12小时。若未立即使用，每3天更换一次MEF培养基。若接种后7天内未使用，则弃去MEF细胞。
2. 将mESCs（接种密度为1-4 × 10⁴ 个细胞/cm²）加入含小鼠白血病抑制因子（mLIF）（1,000 U/mL）的mESC培养基中，接种至MEF培养板。于37 °C、相对湿度≥95%、5% CO₂ 条件下孵育细胞。
3. 当培养皿中细胞融合度达到约70-80%，或克隆开始相互接触时，使用胰蛋白酶-EDTA（0.05%胰蛋白酶）按1:5至1:10比例传代mESCs。通常每2天传代一次，但根据初始接种密度不同，也可能需要4至5天。
4. 将mESCs维持在MEF饲养层及mESC培养基中，以保持其多能性。
5. 开始分化前，至少将细胞在无MEF的明胶包被培养板上传代一次，以稀释去除残留的MEF细胞。​
   1. 通过向经组织培养处理的培养皿中加入含Ca²⁺/Mg²⁺ 的磷酸盐缓冲液（PBS）中配制的0.1%明胶溶液，并于37 °C孵育至少1小时，制备明胶包被培养板。每10 cm培养板接种1.5-2 × 10⁶ 个细胞（2.7-3.6 × 10⁴ 个细胞/cm²），并在开始分化前让细胞扩增2天。

3. 将小鼠胚胎干细胞分化为类似MGE的端脑前体细胞

1. 分化第0天（DD 0）= “悬浮细胞”​
   1. 小鼠胚胎干细胞（mESCs）在明胶包被的培养皿中培养2天后，吸除培养基，用不含 Ca²⁺/Mg²⁺ 的 PBS 洗涤细胞一次。加入足量胰蛋白酶-EDTA（0.05% 胰蛋白酶）覆盖培养皿表面（通常一个10 cm组织培养皿加入4 mL胰蛋白酶-EDTA），将细胞放回37 °C、相对湿度 ≥95%、5% CO₂ 的培养箱中孵育4分钟。
   2. 4分钟后，用两倍体积的mESC培养基中和胰蛋白酶-EDTA。将细胞转移至适当大小的离心管中，在200 × g 条件下离心5分钟。5分钟后取出离心管，吸除上清液，注意不要扰动细胞沉淀。用1 mL含BMP抑制剂LDN-193189（250 nM）和Wnt抑制剂XAV-939（10 µM）的KSR:N2培养基（1:1）重悬细胞沉淀。
   3. 使用血细胞计数板或自动细胞计数仪测定细胞浓度。在非黏附性组织培养皿中，以75,000 个细胞/mL的密度，将细胞接种于含LDN-193189（250 nM）和XAV-939（10 µM）的KSR:N2培养基（1:1）中，开始形成拟胚体（EBs）。将细胞置于37 °C、相对湿度 ≥95%、5% CO₂ 的培养箱中孵育。
2. 在DD1，为细胞“着陆”做准备：用聚-L-赖氨酸（10 µg/mL溶于含Ca²⁺/Mg²⁺ 的PBS）包被组织培养处理过的培养皿，37 °C、相对湿度 ≥95% 条件下过夜（O/N）或至少1小时。
3. 在DD2，吸除聚-L-赖氨酸，用层粘连蛋白（10 µg/mL溶于含Ca²⁺/Mg²⁺ 的PBS）包被培养皿，37 °C、相对湿度 ≥95% 条件下过夜（O/N）。
   注意：尽管过夜包被效果最佳，但至少2小时也可能足够。若培养皿次日不用，应吸除层粘连蛋白，替换为不含Ca²⁺/Mg²⁺ 的PBS，并在4 °C保存不超过2周。
4. DD3（“着陆细胞”）
   1. 开始拟胚体（EB）解离前，吸除层粘连蛋白，将培养皿置于组织培养超净台中完全晾干。避免使用表面发亮或明显湿润的培养皿。将含培养基的EBs转移至15 mL离心管中，在15 × g 条件下离心3–4分钟，或直至EBs完全沉淀。
5. 吸除上清液，加入3 mL含DNase（2 U/mL）的细胞解离溶液，在37 °C、相对湿度 ≥95%、5% CO₂ 条件下孵育15分钟。每3分钟轻轻敲击离心管一次，以促进EBs解离。
6. 当EBs不再可见或孵育时间已达15分钟时，加入6 mL含DNase（1 U/mL）的KSR:N2（1:1）培养基，在200 × g 条件下离心5分钟。
7. 将细胞以4.5–5 × 10⁴ 个细胞/cm² 的密度接种于含LDN-193189（250 nM）、XAV-939（10 µM）以及ROCK抑制剂Y-27632（10 µM）的KSR:N2（1:1）培养基中。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
小鼠胚胎成纤维细胞（CF-1 MEF IRR 7M）	MTI-Globalstem	GSC-6101G	1 瓶 7M MEFs 足够用于四个 10 cm 细胞培养板。
FBS	Atlanta Biologicals	S11150H
Primocin	Invivogen	Ant-pm-2	又称抗菌剂。不要与基础培养基一同过滤——应在过滤后加入。
N2 补充剂-B	Stemcell Technologies	7156	不要与基础培养基一同过滤——应在过滤后加入
Glutamax（100×）	ThermoFisher	35050061	又称 L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。
KnockOut 血清替代物（KSR）	ThermoFisher	10828028	又称无血清培养基补充剂。
L-谷氨酰胺（100×）	ThermoFisher	25030081
MEM-NEAA（100×）	ThermoFisher	11140050
2-巯基乙醇	ThermoFisher	21985023
KnockOut DMEM	ThermoFisher	10829018
Hyclone FBS	VWR	82013-578	又称干细胞级 FBS。
组织培养处理培养皿（10 cm）	BD Falcon	353003
非黏附无菌培养皿（10 cm）	VWR	25384-342
白血病抑制因子（mLIF）	Chemicon	ESG1107	切勿冷冻，4°C 保存。
DMEM/F12	ThermoFisher	11330032
0.1% 明胶溶液	ATCC	ATCC PCS-999-027
层粘连蛋白	Sigma	L2020
聚-L-赖氨酸	Sigma	P6282
胰蛋白酶-EDTA（0.05%）	ThermoFisher	25300054
Accutase	ThermoFisher	A1110501	又称不含胰蛋白酶的细胞解离试剂。
RQ1 无 RNase DNase	Promega	M610A
LDN-193189	Stemgent	04-1974	用 DMSO 溶解并分装成单次使用量，-80°C 保存
XAV939	Stemgent	04-1946	用 DMSO 溶解并分装成单次使用量，-80°C 保存
ROCK 抑制剂（Y-27632）	Tocris	1254	用 DMSO 溶解并分装成单次使用量，-80°C 保存