通过悬滴法从小鼠胚胎干细胞生成神经前体细胞

摘要

来源：Hanafiah, A.，等。从小鼠胚胎干细胞分化与鉴定神经前体细胞及神经元。J. Vis. Exp. (2020)。

该视频展示了通过悬滴法将小鼠胚胎干细胞（mESCs）分化为类胚体（EBs）的过程。将mESCs悬置于悬滴中孵育后，细胞聚集形成EBs，并进一步在添加了视黄酸（RA）的分化培养基中分化为神经前体细胞（NPCs）。

方案

1. mESC 培养

1. 用 0.1% 明胶包被一个 10 cm 的组织培养处理板，并让明胶在吸出前静置至少 15–30 分钟。
2. 在培养小鼠胚胎干细胞（mESCs）前一天，将经 γ 射线照射的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）接种于预热的 mESC 培养基中（含 15% 胎牛血清（FBS）、非必需氨基酸、β-巯基乙醇、L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素、丙酮酸钠、白血病抑制因子（LIF）、PD0325901（PD）和 CHIR99021（CH）的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM））。
3. 在接种 E14 细胞前，让经 γ 射线照射的 MEFs 沉降并贴附于培养板表面。
4. 在 37 °C 水浴中快速解冻 E14 ESCs，并立即转移至含预热 mESC 培养基的 15 cm 圆锥形离心管中。在 200 x g 条件下离心 3 分钟以收集细胞，弃去上清液。
5. 将细胞重悬于 10 mL mESC 培养基中，并接种至先前已接种 γ 射线照射 MEFs 的培养板中。将细胞培养物置于 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中孵育。
6. 进行传代培养时，吸除培养基，并用无菌 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤培养板。加入足量 0.05% 胰蛋白酶以覆盖培养板表面，于 37 °C 孵育 3 分钟。
7. 用 mESC 培养基中和胰蛋白酶，并吹打形成单细胞悬液。在 200 x g 条件下离心 3 分钟，弃去上清液。
8. 使用血细胞计数板或细胞计数仪计数细胞，并将约 5.0 × 10⁵ 个细胞接种至 10 cm 培养板中。
9. 将细胞重悬于 10 mL mESC 培养基中，接种至明胶包被的组织培养板上，并按前述条件进行培养。
   注意：建议每 2 天传代一次 mESCs，以防止细胞在克隆中发生分化。培养基中的酚红仅作为 pH 指示剂，根据细胞密度不同，可能在不到 2 天内变为黄色（更偏酸性），因此可能需要每天更换培养基。经 γ 射线照射的 MEFs 在数次传代后将逐渐死亡。

2. 胚状体、神经前体细胞及神经元分化

1. 执行细胞传代培养操作并计数细胞。
2. 悬滴法（第0天）
   1. 对于一个10 cm的细胞培养皿，准备约2.5 × 10⁴ 个细胞，将其中5.0 × 10² 个细胞悬浮于20 µL分化培养基中（DMEM，含15% FBS、非必需氨基酸、β-巯基乙醇、L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素和丙酮酸钠）。一个10 cm培养皿的皿盖上可放置约五十个含细胞的20 µL液滴。
   2. 取适当数量的细胞，以200 × g 离心3分钟，弃去上清液。
   3. 将细胞重悬于适量的分化培养基中，使细胞密度为每20 µL含5.0 × 10² 个细胞（例如，2.5 × 10⁴ 个细胞溶于1 mL分化培养基）。
   4. 使用微量移液器或重复移液器，将20 µL细胞悬液液滴加至组织培养皿的皿盖内表面。确保液滴之间保持足够距离，防止其融合。
      注意：由于液滴置于皿盖而非培养皿底部，因此可使用经组织培养处理的贴壁培养皿或悬浮培养皿。为便于操作并保持无菌，建议先将液滴加至贴壁培养皿的皿盖，随后按以下步骤转移至悬浮培养皿。
   5. 在培养皿底部加入5–10 mL的1× PBS，然后小心将皿盖放回。将培养物置于37 °C培养箱中孵育。
      注意：在培养皿中加入PBS是为了防止液滴干燥。
3. 在 第2天，使用微量移液器收集皿盖上的液滴，并将其转移至含有10 mL分化培养基的10 cm细胞悬浮培养皿中。将培养物置于培养箱内的轨道摇床上，以低速振荡孵育。
4. 在 第4天，为收集拟胚体（EBs），收集细胞，以200 × g 离心3分钟，弃去上清液。
   注意：可根据后续实验要求，用1× PBS洗涤EBs。
5. 为继续实验并诱导EBs向神经前体细胞（NPCs）分化，配制含5 µM视黄酸（RA）的分化培养基。
6. 通过以100 × g 离心3分钟使EBs沉淀，或静置使其自然沉降，吸除旧培养基。向培养皿中加入10 mL含5 µM RA的分化培养基。
7. 在第6天，通过倾斜培养皿并用移液器吸出部分培养基的方式，更换至少一半的培养基为含5 µM RA的新鲜培养基。
   注意：建议在第5天和第7天也至少更换一半含RA的新鲜培养基。注意观察酚红指示剂颜色；若变为黄色，建议更换全部培养基。
8. 在 第8天，通过收集细胞、以200 × g 离心3分钟并弃去上清液的方式收获NPCs。
   注意：可根据后续实验需求，用1× PBS洗涤NPCs。如需保存，NPCs可冻存并在后续实验中复苏培养与分析。若需进行培养，Accutase可作为胰蛋白酶的替代消化试剂使用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.05% 胰蛋白酶 + 0.53 mM EDTA 1X	Corning	25-052-CV
0.1% 明胶	Sigma	G1890-100G	用去离子水配制
CHIR99021	Cayman Chemicals	13122
DMEM	Corning	10-017-CM
DMEM/F12 培养基	Thermo Fisher Scientific	11320033
EB 缓冲液	Qiagen	19086
乙醇	111000200	Pharmco	用去离子水稀释
胎牛血清	Atlanta Biologicals	S10250
L-谷氨酰胺	Thermo Fisher Scientific	25030024
LIF	N/A	N/A	从小鼠胚胎成纤维细胞上清液中收集
MEM 非必需氨基酸	Corning	25-025-Cl
PD0325901	Cayman Chemicals	13034
青霉素/链霉素	Corning	30-002-Cl
磷酸盐缓冲液 (PBS)	N/A	N/A	用去离子水配制
氯化钾	P217-500G	VWR
无水磷酸二氢钾	0781-500G	VWR
氯化钠	BP358-10	Fisher Bioreagents
磷酸氢二钠七水合物	SX0715-1	Milipore
视黄酸	Sigma	R2625	用 DMSO 配制
丙酮酸钠	Corning	25-000-Cl
β-巯基乙醇	Fisher BioReagents	BP176-100