造血祖细胞直接重编程为神经干细胞

摘要

来源：Wang, T.，等。从外周血造血祖细胞直接诱导人神经干细胞。J. Vis. Exp，（2015）

本视频展示了将基因修饰的造血祖细胞直接重编程为神经干细胞的过程。造血祖细胞表达的转录因子触发了一系列分子事件，促进其转化。随后使用特定的培养基来筛选并扩增诱导产生的神经干细胞。

方案

1. 神经干细胞诱导

注意：根据细胞状态，转染后约5至7天，单层贴壁细胞将达到30%–50%融合度（图1C）。

1. 移去含有悬浮细胞和细胞球的上清液，然后向贴壁细胞中加入1 ml神经前体细胞培养基（DMEM/F12培养基，含1× N2添加剂、0.1% (w/v) 牛血清白蛋白（BSA）、1% (v/v) 抗生素、20 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和20 ng/ml表皮生长因子（EGF））。
2. 可选：通过轻柔吹打使细胞球解离，并在170 × g条件下离心10分钟。弃去上清液，将细胞重悬于1 ml神经前体细胞培养基中，接种至预先用Matrigel包被的新24孔板中作为备用。
3. 每隔一天更换一次培养基，直至细胞达到60–80%融合度，通常需要1周时间。
4. 弃去上清液，加入1 ml神经干细胞培养基（无血清培养基，NSC SFM）。使用细胞刮刀刮下细胞，随后进行极轻柔的吹打使细胞悬浮。
5. 收集细胞，并将全部细胞接种至1个6孔板的单孔中。再加入1 ml神经干细胞培养基，使每孔总体积为2 ml。将细胞置于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育。
6. 每隔一天更换一次培养基。
7. 当细胞达到60%融合度时，按照步骤1.4和1.6的操作，以1:3的比例进行解离和传代。

结果

图1. CD34细胞在仙台病毒转染后的形态学变化。 （A）转染时可观察到大量CD34细胞。（B）仙台病毒转染后24小时可观察到类球状的细胞聚集体，且随时间逐渐扩大。（C）转染5天后主要出现双极贴壁细胞。（D）和（E）使用神经前体细胞培养基诱导并扩增后，显示出典型的神经干细胞形态。比例尺：（A）和（B）为200 µm，其余为400 µm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞刮刀	Sarstedt	83.183
DMEM/F12	Life technologies	12400-024	1X
N2 添加剂	Life technologies	17502-048	1X
牛血清白蛋白	Sigma	A2934	0.1% (w/v)
bFGF	Peprotech	100-18B	20 ng/ml
EGF	Peprotech	AF-100-15
B27 添加剂	Life technologies	17504-044	1X
NSC 无血清培养基	Life Technologies	A1050901	1X