siRNA介导的神经干细胞基因沉默

摘要

来源：Nguyen, B. H., 等. O9-1 神经嵴细胞的培养与操作. J. Vis. Exp (2018)

本视频展示了利用小干扰RNA（siRNA）在神经干细胞中沉默特定目的基因，并通过适当的分化培养基将其诱导分化为所需细胞类型的方法。该实验流程可用于研究特定基因在神经干细胞分化过程中所发挥的关键作用。

方案

1. O9-1 细胞的操作

1. 在 O9-1 细胞中进行 siRNA 基因敲低
   1. 实验开始前，解冻并用基底膜基质包被 24 孔板。复苏 O9-1 细胞并接种，使其生长至 60% 至 80% 汇合度。
   2. 根据相应孔体积，用无血清培养基稀释脂质体。将 siRNA 用无血清培养基稀释至终浓度。按照制造商推荐的比例，将稀释后的 siRNA 加入稀释后的脂质体中。用移液器充分混匀，然后孵育。
      注意：请遵循制造商关于孵育体积、时间和温度的说明。
   3. 根据制造商的建议，向细胞中加入适当体积的 siRNA-脂质复合物。
   4. 将细胞在标准细胞培养孵箱中孵育 24 小时（37 °C，5% CO₂）。根据需要进行后续操作（提取 RNA、提取蛋白质、染色等）。
      注意：siRNA 基因敲低的时间和浓度可能因具体实验而异。

2. O9-1 细胞分化

1. 将 O9-1 细胞分化为成骨细胞
   1. 制备成骨分化培养基：将以下成分加入α-MEM中稀释（括号内为终浓度）：0.1 μM ....

结果

图1： 成骨细胞标志物骨钙素（Ocn）的免疫荧光染色显示，在成骨分化条件下，O9-1细胞可分化为成骨细胞。 使用成骨细胞标志物Ocn抗体（绿色）对细胞进行染色，细胞核用DAPI（蓝色）染色。箭头指示Ocn阳性细胞。骨钙素（Ocn，成骨细胞标志物）；DAPI（′,6-二脒基-2-苯基吲哚）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
O9-1 小鼠颅神经嵴细胞系	Millipore Sigma	SCC049
DMEM，高糖，无谷氨酰胺	Gibco	11960-044
DMEM，高糖	Hyclone	SH30243.01
FBS（胎牛血清）	Millipore Sigma	ES-009-B
青霉素-链霉素	Gibco	15140-122
L-谷氨酰胺 200 mM（100×）	Gibco	25030-081
HBSS 中的 0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Genesee Scientific	25-510
不含钙和镁的DPBS（Dulbecco磷酸盐缓冲液）	Lonza	17-512F
MEM非必需氨基酸（MEM NEAA）100X	Gibco	11140-050
丙酮酸钠（100 mM）	Gibco	11360-070
2-巯基乙醇	Sigma	M-7522
重组人碱性成纤维细胞生长因子（rhFGF-basic）	R&D 系统	233-FB-025
丝裂霉素C	罗氏	10107409001
Matrigel基质	康宁	356234
DMSO（二甲基亚砜）	Millipore Sigma	MX1458-6
Lipofectamine RNAiMAX	赛默飞世尔科技	13778-075
Opti-MEM I（1×）	Gibco	31985-070
最低必需培养基，α 1X，含伊格尔盐、核糖核苷、脱氧核糖核苷 & L-谷氨酰胺	康宁	10-022-CV
ON-TARGETplus Wwtr1 siRNA	Dharmacon	L-041057
ON-TARGETplus 非靶向对照池	Dharmacon	D-001810
ON-TARGETplus Yap1 siRNA	Dharmacon	L-046247
FCS（胎牛血清）
ITS（胰岛素-转铁蛋白-硒）
TGF-β3
抗坏血酸
BMP2（骨形态发生蛋白2）
地塞米松
B-27 添加剂