siRNA-Mediated Gene Silencing in Neural Stem Cells

doi:10.3791/31049

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Research Article

神经干细胞中 siRNA 介导的基因沉默

July 8, 2025

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Abstract

来源:Nguyen， B. H. et al. O9-1 神经嵴细胞的培养和作。J. Vis. Exp （2018 年）

该视频演示了如何使用小干扰 RNA （siRNA）沉默神经干细胞中的特定目标基因，并使用适当的分化培养基将其分化为所需的细胞类型。该程序能够研究特定基因在神经干细胞分化过程中的关键作用。

Protocol

1. O9-1 细胞的作

在 O9-1 细胞中进行 siRNA 敲低
1. 在开始实验之前，解冻并用基底膜基质涂覆 24 孔板。回收并接种 O9-1 细胞，使它们生长至 60% 至 80% 汇合度。
2. 根据适当的孔体积在无血清培养基中稀释脂质体。在无血清培养基中稀释 siRNA 至最终浓度。按照制造商推荐的比例将稀释的 siRNA 添加到稀释的脂质体中。通过移液充分混合，然后孵育。
  注意:按照制造商的指南了解使用的体积、时间和孵育温度。
3. 根据制造商的建议，向细胞中加入适当体积的 siRNA-脂质复合物。
4. 在标准细胞培养箱（37°C，5% CO_{2 ）}中孵育细胞 24 小时。根据需要执行下游步骤（提取 RNA、提取蛋白质、染色等）
  注:siRNA 敲低时间和浓度可能因单个实验而异。

2. O9-1 细胞分化

O9-1 细胞分化为成骨细胞
1. 为了制备成骨分化培养基，请在 alpha-MEM 中稀释以下物质（标明最终浓度）:0.1 μM 地塞米松、100 ng/mL 骨形态发生蛋白 2 （BMP2）、50 μg/mL 抗坏血酸、10 mM 甘油磷酸乙酯、10% FBS、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素。
2. 通过免疫染色检测分化成骨细胞中的成骨细胞标志物骨钙素，如图 1.
  所示 注意:成骨分化也可以通过使用其他成骨细胞标志物或茜素红染色或碱性磷酸酶染色来评估。
O9-1 细胞分化为平滑肌细胞
1. 要制备平滑肌细胞分化培养基，请在 DMEM 中稀释以下物质（标明最终浓度）:100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素和 10% FBS。
2. 通过使用针对平滑肌细胞标志物的抗体，如平滑肌肌动蛋白（SMA），通过免疫荧光染色评估平滑肌细胞分化，如图 2 所示。

Representative Results

图 1
图 1:成骨细胞标志物骨钙素（Ocn）的免疫荧光染色表明 O9-1 细胞在成骨分化条件下产生成骨细胞。细胞用成骨细胞标志物 Ocn 抗体（绿色）染色，细胞核用 DAPI （蓝色）染色。箭头表示 Ocn 阳性细胞。骨钙素（Ocn，一种成骨细胞标志物）;DAPI （′，6-二脒基-2-苯基吲哚）。

图 2
图 2:平滑肌肌动蛋白（SMA）的免疫荧光染色表明，在平滑肌细胞分化条件下，大多数野生型 O9-1 细胞产生平滑肌细胞（A），而 Yap-null O9-1 细胞未能分化为平滑肌细胞（B）。细胞用 SMA 抗体（红色）染色，细胞核用 DAPI（蓝色）染色。箭头表示 SMA 阳性细胞。

Disclosures

No conflicts of interest declared.

Materials

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> O9-1 小鼠颅神经嵴细胞系 Millipore Sigma SCC049 DMEM，高葡萄糖，无谷氨酰胺吉布科邮编 11960-044 DMEM，高血糖海克隆 SH30243.01 FBS（胎牛血清） Millipore Sigma ES-009-B 系列青霉素 - 链霉素吉布科 15140-122 L-谷氨酰胺 200 毫米（100X）吉布科编号:25030-081 胰蛋白酶-EDTA 0.25% HBSS 溶液杰纳西科学 25-510 元不含钙或镁的 DPBS（Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水）龙沙 17-512F MEM 非必需氨基酸（MEM NEAA） 100X 吉布科邮编 11140-050 丙酮酸钠（100 mM）吉布科邮编 11360-070 2-巯基乙醇西格马货号 M-7522 重组人成纤维细胞生长因子-碱性（rhFGF-basic）研发系统编号:233-FB-025 丝裂霉素 C 罗氏 10107409001 基质胶基质康宁 356234 DMSO（二甲基亚砜） Millipore Sigma MX1458-6 系列 Lipofectamine RNAiMAX 抗体赛默飞世尔科技 13778-075 Opti-MEM I （1X）系列吉布科编号:31985-070 最低必需的培养基，含厄尔盐、核糖核苷、脱氧核糖核苷和L-谷氨酰胺的α 1X 康宁编号:10-022-CV ON-TARGETplus Wwtr1 siRNA 法货号: L-041057 ON-TARGETplus 非定向池法编号: D-001810 ON-TARGETplus Yap1 siRNA 法货号: L-046247 FCS（胎牛血清） ITS（胰岛素-转铁蛋白-硒） TGF-b3 抗坏血酸 BMP2 （骨形态发生蛋白 2）地塞米松 B-27 补充剂

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