分离由成人人类成纤维细胞衍生的诱导性神经前体细胞克隆

摘要

来源：Meyer, S. 等，成年人大类纤维细胞的获取及其直接转化为可扩增神经前体细胞的方法 J. Vis. Exp. (2015)。

本视频演示了一种分离由成人人类成纤维细胞衍生的诱导性神经前体细胞（iNPCs）的技术。该方法概述了分离iNPC克隆并将其培养于经层粘连蛋白包被的多孔板孔中的步骤，同时使用适宜的培养基，以促进iNPC群体的持续增殖与扩增。

方案

所有涉及样本采集的程序均按照本机构的IRB指南进行。

1. 分离拟诱导神经前体细胞（iNPC）克隆集落

1. 在挑取iNPC集落前一天，用层粘连蛋白包被一块48孔板：将层粘连蛋白用杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）稀释至1 µg/ml，每孔加入300 µl溶液，4 °C孵育24小时。一天后，吸去孔板中的层粘连蛋白溶液，每孔加入200 µl神经诱导培养基（1:1 DMEM/F-12:Neurobasal，1× N2，1× B27，1% GlutaMAX，10 ng/ml人白血病抑制因子，3 μM CHIR99021，2 μM SB431542）。
2. 用DPBS洗涤含有待挑取集落的6孔板一次，每孔加入2 ml神经诱导培养基。机械法挑取集落：用细针在集落周围刮除周围的细胞；将200 µl移液器设定为50 µl，使用相应的吸头挑取集落。
3. 将每个集落转移至一块经层粘连蛋白包被的48孔板的各个孔中，通过上下吹打10次机械性地制成单细胞悬液。向细胞中加入ROCK抑制剂Y27632，终浓度为10 µM。
4. 将细胞在37 °C、5% CO₂条件下培养2天。每隔两天更换一次培养基，直至细胞达到80–90%汇合度（约3–4天）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CHIR99021	Axon medchem	1386
DMEM/F12	LifeTechnologies	11320-033
DPBS	LifeTechnologies	14190-094
GlutaMAX	LifeTechnologies	35050-038
hLIF	Peprotech	300-05
层粘连蛋白	Sigma	L2020
N2	LifeTechnologies	17502-048
Neurobasal	LifeTechnologies	21103-049
SB431542	Invivogen	inh-sb43
Y27632	Calbiochem	CAS 146986-50-7
B27	LifeTechnologies	17504-044