利用高密度神经元饲养层制备超低密度神经元培养物

摘要

来源：Lu, Z. 等，一种简化的大鼠原代海马神经元超低密度长期培养方法 J. Vis. Exp. (2016)。

本视频展示了在高密度神经元饲养层存在下培养超低密度神经元的方法。该方法建立了不同密度神经元的共培养体系，确保神经元之间紧密的物理接近。高密度神经元分泌的生长因子有助于神经元的存活和生长，从而延长超低密度神经元的维持时间。

方案

1. 高密度神经元培养用24孔板的制备

注意：在计划收获胚胎的前一天完成以下步骤（2-3）。

1. 将两个24孔板带入细胞培养操作台，并打开各自的包装。
2. 将一支18 G的注射针头连接到1 ml塑料一次性注射器上。
3. 手持注射器，将针尖对准孔底中心左侧约1 mm处。施加适度的力度（约250 g），在孔底划出一条长约1 mm的刻痕。此时会形成一道凹槽，被移位的塑料材料将在平坦的孔底表面形成凸起的支撑结构。以类似方式，在孔底中心右侧约1 mm处再刻出另一条长约1 mm的平行凹槽。
4. 对两个24孔板的所有孔重复此步骤。用于高密度培养的这两个24孔板现已准备就绪，可进行聚-D-赖氨酸包被（见下文步骤2.8）。

2. 低密度神经元培养用盖玻片的制备

1. 使用直径为 12 mm 的 #1 圆形玻璃。
2. 将 50 个盖玻片放入一个直径为 100 mm 的无菌塑料培养皿中，并用 20 ml 70% 乙醇溶液浸没盖玻片。将该培养皿置于旋转平台上，以中等速度（70 rpm）旋转 1 小时。移除 70% 乙醇，更换为新鲜的 70% 乙醇，再次旋转洗涤 1 小时。
3. 弃去 70% 乙醇清洗液。加入通过 0.2 µm 滤器过滤的无菌水。用手轻轻旋转培养皿，充分冲洗盖玻片。重复冲洗三次，每次均更换新鲜的无菌水。
4. 将装有盖玻片的培养皿置于具有层流的无菌细胞培养操作台内。通过真空管线吸去冲洗水，并加入 10 ml 过滤后的无菌水以浸没盖玻片。此时盖玻片应为无菌状态，且表面足够洁净，可用于聚-D-赖氨酸包被。
5. 打开两个 24 孔板的独立包装，并将其放入操作台内。
6. 开启操作台内的真空管线。将一个 200 µl 移液枪头连接至真空管线，并用剪刀剪去枪头尖端以形成较大的开口。
7. 使用细尖 #5 镊子从培养皿中逐个夹取盖玻片，并利用真空管线将盖玻片彻底吹干。然后将每个盖玻片放入 24 孔板的各个孔中。50 个清洗后的盖玻片应足以填满两个 24 孔板的所有孔。
8. 用硼酸盐缓冲液（pH 8.5）将聚-D-赖氨酸储存液（1 mg/ml）稀释成工作液（0.1 mg/ml）。针对四个 24 孔板（包括两个带刻蚀底的高密度孔板），共需配制 30 ml 工作液。
9. 向每个含有玻璃盖玻片的孔中加入 300 µl 0.1 mg/ml 聚-D-赖氨酸工作液。确保盖玻片完全浸没在溶液中。若未完全浸没，可用 #5 镊子尖端轻压盖玻片使其贴附于孔底，并用枪头引导聚-D-赖氨酸溶液覆盖盖玻片整个表面。肉眼检查所有孔，确保盖玻片与孔底之间无气泡残留。
10. 向带刻蚀底的高密度培养板的每个孔中加入 300 µl 0.1 mg/ml 聚-D-赖氨酸工作液。用手轻轻旋转，使溶液均匀覆盖孔底的整个表面。
11. 将四个加有聚-D-赖氨酸的孔板放回培养箱中，过夜孵育。

3. 培养用板的洗涤与预处理

注意：以下步骤（3-5）在组织收获当天进行。

1. 在盖玻片和24孔板过夜孵育/包被后，将全部四个板（两个含供体盖玻片，两个为带蚀刻塑料底的受体高密度板）移入细胞培养操作台。使用真空管线吸除聚-D-赖氨酸溶液。
2. 在去除聚-D-赖氨酸溶液后，立即使用塑料移液管向每孔加入约1 ml无菌水。待所有孔均加满水后，静置10分钟。用真空泵吸除水分，然后每孔加入300 µl洗涤培养基，以覆盖孔底（无论是否含有玻璃盖玻片）。注意避免聚-D-赖氨酸包被层干燥。
3. 将全部四个板放回细胞培养箱。待分散的海马神经元制备完成后，即可使用这些板。

4. 神经元的铺板与长期共培养

1. 将两块带刻蚀底部的24孔板（用于高密度神经元培养）放入细胞培养操作台。用真空泵吸除300 µl预培养培养基。每孔接种0.6 ml浓度为250,000个神经元/ml的高密度细胞悬液。
2. 将另外两个含有盖玻片的24孔板带入培养罩内，用真空法吸除每孔中的300 µl预处理培养基。在两个24孔板的盖玻片上，分别接种0.6 ml密度为10,000个神经元/ml的低密度细胞悬液。
3. 将全部四个24孔板放回培养箱，静置2小时。
4. 将带有贴壁神经元的低密度盖玻片翻转至高密度培养物上，确保神经元相对排列（即，未被玻璃盖玻片隔开）。然后将共培养的两块培养板放回培养箱中。

5. 共培养维持

1. 在第天向共培养体系中加入 300 µl 新鲜饲养培养基（见材料） 体外 （体外培养第5天）无需像许多其他研究中报道的那样更换50%的原始完全培养基。换液所用培养基中还含有15 µM 阿糖胞苷（Ara-C，终浓度为5 µM），以尽量减少胶质细胞污染和增殖。
2. 初次喂养后，每周向孔中加入 300 µl 新鲜喂养培养基（不含 Ara-C）。若培养时间超过一个月，则从一个月时间点之后开始，每周更换一半培养基为新鲜喂养培养基（首次半量换液时间为 DIV33）。形态学上，高密度和低密度神经元在三个月内均保持健康状态（此为实验人员观察到的最长时间）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Neurobasal 培养基	Life Technologies	21103-049	避光保存
B27添加剂	Life Technologies	17504-044	分装，储存于0.6 ml容器中
GlutaMAX-I	Life Technologies	35050-061	稀释100倍
抗生素-抗真菌剂（AA）	Life Technologies	15240-096	稀释100倍
完全培养基			含1× B27、1× AA、1× GlutaMAX-I的Neurobasal培养基
洗涤液			与“Neurobasal培养基”相同
培养基			Neurobasal 培养基添加 1X B27 补充剂
poly-D-赖氨酸	Sigma-Aldrich	P6407	相对分子质量 70000-150000
硼酸盐缓冲液	Sigma-Aldrich	B6768（硼酸）；71997（硼砂）	1.24 g 硼酸 & 1.9 g 硼砂溶于 400 ml H2O 中，用 HCl 调 pH 至 8.5
12毫米圆形玻璃盖玻片	Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH	1001/12	1 号玻璃片，购自 Carolina Biological Supply