利用高密度神经元饲养层制备超低密度神经元培养物

摘要

来源：Lu, Z. 等，一种简化的大鼠原代海马神经元超低密度长期培养方法 J. Vis. Exp. (2016)。

本视频展示了在高密度神经元饲养层存在下培养超低密度神经元的方法。该方法建立了不同密度神经元的共培养体系，确保神经元之间紧密的物理接近。高密度神经元分泌的生长因子有助于神经元的存活和生长，从而延长超低密度神经元的维持时间。

方案

1. 高密度神经元培养用24孔板的制备

注意：在计划收获胚胎的前一天完成以下步骤（2-3）。

1. 将两个24孔板带入细胞培养操作台，并打开各自的包装。
2. 将一支18 G的注射针头连接到1 ml塑料一次性注射器上。
3. 手持注射器，将针尖对准孔底中心左侧约1 mm处。施加适度的力度（约250 g），在孔底划出一条长约1 mm的刻痕。此时会形成一道凹槽，被移位的塑料材料将在平坦的孔底表面形成凸起的支撑结构。以类似方式，在孔底中心右侧约1 mm处再刻出另一条长约1 mm的平行凹槽。
4. 对两个24孔板的所有孔重复此步骤。用于高密度培养的这两个24孔板现已准备就绪，可进行聚-D-赖氨酸包被（见下文步骤2.8）。

2. 低密度神经元培养用盖玻片的制备

1. 使用直径为 12 mm 的 #1 圆形玻璃。
2. 将 50 个盖玻片放入一个直径为 100 mm 的无菌塑料培养皿中，并用 20 ml 70% 乙醇溶液浸没盖玻片。将该培养皿置于旋转平台上，以中等速度（70 rpm）旋转 1 小时。移除 70% 乙醇，更换为新鲜的 70% 乙醇，再次旋转洗涤 1 小时。
3. 弃去 70% 乙醇清洗液。加入通过 0....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Neurobasal 培养基	Life Technologies	21103-049	避光保存
B27添加剂	Life Technologies	17504-044	分装，储存于0.6 ml容器中
GlutaMAX-I	Life Technologies	35050-061	稀释100倍
抗生素-抗真菌剂（AA）	Life Technologies	15240-096	稀释100倍
完全培养基			含1× B27、1× AA、1× GlutaMAX-I的Neurobasal培养基
洗涤液			与“Neurobasal培养基”相同
培养基			Neurobasal 培养基添加 1X B27 补充剂
poly-D-赖氨酸	Sigma-Aldrich	P6407	相对分子质量 70000-150000
硼酸盐缓冲液	Sigma-Aldrich	B6768（硼酸）；71997（硼砂）	1.24 g 硼酸 & 1.9 g 硼砂溶于 400 ml H2O 中，用 HCl 调 pH 至 8.5
12毫米圆形玻璃盖玻片	Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH	1001/12	1 号玻璃片，购自 Carolina Biological Supply