来源：Shipley, M. M.，等。人源神经母细胞瘤 SH-SY5Y 细胞系的分化。J. Vis. Exp. (2016)。
本视频展示了一种利用系统性传代技术将未分化的SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞转化为完全分化的成熟神经元的方法。该方法包括将细胞培养于一系列血清浓度逐步降低的培养基中，以抑制类上皮细胞的增殖，同时促进类神经元细胞的分化与扩增。此外，培养基中添加了视黄酸和特定的生长因子，可诱导类神经元细胞终末分化为具有广泛分支形态的成熟神经元。
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方法文章
人神经母细胞瘤细胞系向成熟神经元的分化
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
1. 一般注意事项
- 参见材料/设备表以获取所需试剂的清单。所有步骤均须在严格的无菌条件下进行。
- 凡涉及胎牛血清（FBS）的培养基配制，均应使用热灭活胎牛血清（hiFBS）。热灭活方法：将50 ml分装的FBS置于56 °C水浴中加热30分钟，每10分钟颠倒混匀一次（另见表1）。
注意：若FBS未进行热灭活处理，SH-SY5Y细胞培养物中的上皮样表型进展会更快。 - 每次操作前，需将培养基放入培养箱中预热并平衡，以建立适当的pH值。例如，50 ml培养基完全平衡约需一小时（pH 7，37 °C，5% CO2）。
注意：本方案采用两步传代法，需对部分分化的SH-SY5Y细胞进行胰酶消化并重新接种。这对极为脆弱的细胞而言是一个应激过程。因此，必须尽量缩短细胞在胰酶中的孵育时间，以便优先使神经元样细胞脱落，而上皮样细胞仍附着于培养皿表面。 - 使用10 ml塑料移液管对分化后的细胞进行吹打时，应将管尖抵住含细胞的锥形管底部，缓慢操作。吹打速度宜慢，上下吹打不超过五次。
2. 解冻与培养未分化的 SH-SY5Y 神经母细胞瘤细胞
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结果
图1：分化程序时间表。 分化过程共包括11个步骤，历时18天。在分化方案的第一天（第0天），将25,000至100,000个细胞接种到未包被的35 mm培养皿中。在第1、3和5天，移除旧培养基并加入分化培养基#1。第7天，将细胞以1:1比例传代至未包被的35 mm培养皿中，使用分化培养基#1。第8天，更换为分化培养基#2；第10天，细胞再次以1:1比例传代，但此次接种于ECM包被的35 mm培养皿中，并使用分化培养基#2。在第11、14和17天，移除旧培养基并加入分化培养基#3。第18天，已分化的神经元可用于后续实验应用。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| B-27 | ThermoFisher Scientific | 17504-044 | 制备方法见表1 |
| 脑源性神经营养因子（BDNF） | Sigma | SRP3014 (10 μg)/B3795 (5 μg) | 制备方法见表1 |
| 二丁酰环磷酸腺苷（db-cAMP） | Sigma | D0627 | 制备方法见表1 |
| DMSO | ATCC | 4-X | - |
| 最低必需培养基伊格尔（EMEM） | Sigma | M5650 | - |
| 胎牛血清（FBS） | Hyclone | SH30071.03 | 制备方法见表1 |
| GlutamaxI | Life Technologies | 35050-061 | - |
| 谷氨酰胺 | Hyclone | SH30034.01 | - |
| 氯化钾（KCl） | Fisher Scientific | BP366-1 | 制备方法见表1 |
| MaxGel 细胞外基质（ECM）溶液 | Sigma | E0282 | 参见实验方案第11步 |
| Neurobasal | Life Technologies | 21103-049 | - |
| 青霉素/链霉素（Pen/Strep） | Life Technologies | 15140-122 | - |
| 视黄酸（RA） | Sigma | R2625 | 该试剂对光敏感，应避光保存于4 °C |
| SH-SY5Y 细胞 | ATCC | CRL-2266 | - |
| 0.5% 胰蛋白酶 + EDTA | Life Technologies | 15400-054 | - |
| Falcon 35 mm TC 培养皿 | Falcon (A Corning Brand) | 353001 | - |
