人神经母细胞瘤细胞系向成熟神经元的分化

摘要

来源：Shipley, M. M.，等。人源神经母细胞瘤 SH-SY5Y 细胞系的分化。J. Vis. Exp. (2016)。

本视频展示了一种利用系统性传代技术将未分化的SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞转化为完全分化的成熟神经元的方法。该方法包括将细胞培养于一系列血清浓度逐步降低的培养基中，以抑制类上皮细胞的增殖，同时促进类神经元细胞的分化与扩增。此外，培养基中添加了视黄酸和特定的生长因子，可诱导类神经元细胞终末分化为具有广泛分支形态的成熟神经元。

方案

1. 一般注意事项

1. 参见材料/设备表以获取所需试剂的清单。所有步骤均须在严格的无菌条件下进行。
2. 凡涉及胎牛血清（FBS）的培养基配制，均应使用热灭活胎牛血清（hiFBS）。热灭活方法：将50 ml分装的FBS置于56 °C水浴中加热30分钟，每10分钟颠倒混匀一次（另见表1）。
   注意：若FBS未进行热灭活处理，SH-SY5Y细胞培养物中的上皮样表型进展会更快。
3. 每次操作前，需将培养基放入培养箱中预热并平衡，以建立适当的pH值。例如，50 ml培养基完全平衡约需一小时（pH 7，37 °C，5% CO₂）。
   注意：本方案采用两步传代法，需对部分分化的SH-SY5Y细胞进行胰酶消化并重新接种。这对极为脆弱的细胞而言是一个应激过程。因此，必须尽量缩短细胞在胰酶中的孵育时间，以便优先使神经元样细胞脱落，而上皮样细胞仍附着于培养皿表面。
4. 使用10 ml塑料移液管对分化后的细胞进行吹打时，应将管尖抵住含细胞的锥形管底部，缓慢操作。吹打速度宜慢，上下吹打不超过五次。
   

2. 解冻与培养未分化的 SH-SY5Y 神经母细胞瘤细胞

1. 制备基础生长培养基。
2. 在37 °C水浴中快速解冻冻存的细胞（约2分钟）。
3. 在15 ml锥形管中用9 ml基础生长培养基重悬细胞，然后以1,000 × g离心2分钟。
4. 小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀，再用10 ml基础生长培养基轻柔重悬细胞。
5. 将细胞接种至T-25培养瓶或60 mm²培养皿中。
6. 次日更换培养基，以去除死细胞。

第3天：铺板细胞以进行分化

1. 参见图1中的分化时间表。
2. 用1x PBS冲洗未分化细胞，吸除液体，然后加入1-2 ml预热的1x 0.05%胰蛋白酶-EDTA进行消化。
3. 当细胞处于胰蛋白酶溶液中时，在培养箱中孵育约3分钟。
4. 加入10 ml基础生长培养基以终止消化反应，冲洗培养皿或培养瓶内壁，并轻轻吹打1-3次。将全部内容物转移至15 ml锥形离心管中。
5. 在1,000 × g条件下离心2分钟，小心吸除上清液，避免扰动沉淀的细胞团。
6. 用5 ml基础生长培养基重悬细胞沉淀，并轻轻吹打1-3次。
7. 使用血细胞计数板计数细胞，然后用基础生长培养基稀释至50,000个细胞/ml。
8. 每35 mm²培养皿中接种2 ml细胞悬液，使每皿细胞总数为100,000个，随后放回培养箱中继续培养。

第4天：更换培养基（分化培养基#1）

1. 分装 50 ml 分化培养基 #1（见表 2），并在 37 °C 水浴中预热。
2. 待培养基升温后，将其放入培养箱（37 °C，5% CO₂）中至少平衡 1 小时，以建立合适的 pH 值，再进行后续使用。
3. 在将培养基加入培养皿前，立即向已预热并平衡的培养基中加入视黄酸（RA）（见表 1）。
   注意：视黄酸对光敏感，应保存在避光瓶中，并置于 4 °C 环境下
4. 轻柔吸除旧培养基，并弃去。
5. 每 35 mm² 培养皿中加入 2 ml 含视黄酸的分化培养基 #1，然后放回培养箱。

第5天：更换培养基（分化培养基#1）

1. 重复第 4 节（步骤 1-5）

第6天：更换培养基（分化培养基#1）

1. 重复第 4 节（步骤 1-5）

第7天：按1:1比例传代细胞

1. 在将培养基加入培养皿前，立即向预热并平衡好的分化培养基#1中加入RA。
2. 轻柔吸除旧培养基并弃去。
3. 每35 mm²培养皿中加入200 μl预热的0.05% 1x胰蛋白酶EDTA，放入培养箱中孵育约2–3分钟，或直至在显微镜下观察到细胞明显从培养皿表面脱落。
4. 每35 mm²培养皿中加入2 ml含RA的分化培养基#1以终止胰蛋白酶消化作用，并用该培养基冲洗培养皿表面残留的神经元细胞。随后将全部内容物转移至50 ml锥形管中。
   注意：在胰蛋白酶消化过程中，避免同时处理过多培养皿。此举有助于确保神经元培养物不会因在胰蛋白酶中孵育过久而受到细胞毒性影响。
5. 将最多10个培养皿的内容物合并至同一50 ml锥形管中，使用10 ml塑料移液管轻柔上下吹打不超过五次，以充分混匀细胞悬液。
6. 将2 ml细胞悬液分装至新的35 mm²培养皿中，放回培养箱继续培养。

第8天：更换培养基（分化培养基#2）

1. 在将培养基加入培养皿前，立即向已预热并平衡的培养基中加入RA（见表1）。
2. 轻柔吸除旧培养基并弃去。
3. 每35 mm²培养皿缓慢加入2 mL含RA的分化培养基#2（见表2），然后放回培养箱。避免神经元长时间暴露于空气中，以防其快速干燥。

第9天：制备细胞外基质（ECM）包被培养皿

1. 将一管 ECM 溶液在冰上解冻，并按 1:100 的比例加入冷 DMEM 中稀释。
2. 将 2 ml 混合液分装至每个 35 mm² 培养皿中，确保培养皿底部完全覆盖。
3. 置于培养箱（37 °C，5% CO₂）中孵育 1 小时或过夜。
4. 吸除混合液，于生物安全柜中静置晾干约 1 小时。室温下保存，最长可保存 2 个月。

10. 第10天：以1:1比例将细胞转移至ECM包被的培养板

1. 在将培养基加入培养皿前，立即将 RA（见表 1）加入已预热并平衡的培养基中。
2. 轻柔吸除培养基并弃去。
3. 向每个 35 mm² 培养皿中加入 200 μl 预热的胰蛋白酶，于室温孵育约 1–2 分钟，直至在显微镜下观察到神经元明显从培养皿表面脱离。
   注意：此胰蛋白酶消化步骤应在室温下进行，以避免神经元与胰蛋白酶过度孵育造成损伤。此阶段神经元从培养皿脱落的速度远快于类上皮细胞。
4. 通过向每个 35 mm² 培养皿中加入 2 ml 分化培养基 #2 终止胰蛋白酶反应，并用该培养基冲洗培养皿表面残留的神经元细胞，随后将全部内容物转移至 50 ml 圆锥管中。
5. 将最多 10 个培养皿的内容物合并至同一 50 ml 圆锥管中，使用 10 ml 塑料移液管轻柔吹打混悬液，上下吹打不超过五次。
6. 将 2 ml 细胞悬液接种至经 ECM 包被的 35 mm² 培养皿中，放回培养箱继续培养。

11. 第11天：更换培养基（分化培养基#3）

1. 在将培养基加入培养皿前，立即将 RA（参见表 1）加入已预热并平衡的培养基中。
2. 轻柔吸除旧培养基并弃去。
3. 每 35 mm² 培养皿缓慢加入 2 ml 含 RA 的分化培养基 #3（参见表 2），然后放回培养箱。切勿使神经元长时间暴露于空气中。

12. 第14天：更换培养基（分化培养基#3）

1. 重复第 11 节（步骤 1-3）

13. 第17天：最后一次换液（分化培养基#3）

1. 重复第11节（步骤1-3）

14. 第18天：神经元培养物已可使用

1. 每3天更换一次新鲜的含RA的分化培养基#3，以维持神经元的健康。
   注意：细胞应分化为神经元并表现出神经元表型。通常情况下，终末分化后的培养物可稳定维持长达14天。然而，神经元的存活时间取决于分化起始时未分化细胞的传代次数。传代次数越高，所得分化神经元的可用寿命越短。

表1：储备溶液与组分。

组分	详细信息	储存液浓度	操作说明
10 μM RA	全反式维甲酸	5 mM	将 50 mg RA 溶于 33.3 ml 95% 乙醇中。RA 对热、光和空气敏感，需保存于棕色瓶中，4 °C 条件下可保存最多 6 周。使用时按 1:500 比例稀释，并在使用前立即加入分化培养基中
	(300.44 g/mol)
1x B-27	B-27 添加剂	50x	将 1–10 ml 瓶装试剂解冻后，将剩余部分分装为每份 1 ml 的单次使用量，于 -80°C 保存。10 ml 瓶装试剂可直接储存于 -20 °C
20 mM KCl	氯化钾	1 M	将 18.6 g KCl 加入 250 ml 水中，过滤除菌。室温保存
	(74.55 g/mol)
2 mM db-cAMP	二丁酰环磷酸腺苷	1 M	向 1 g db-cAMP 中加入 2.04 ml 水以充分溶解。该物质对光和湿气敏感。建议分装为 100 μl 或 200 μl 的小份，于 -20 °C 或 -80 °C 保存
	(491.37 g/mol)
50 ng/ml BDNF	脑源性神经营养因子 (BDNF)	-	离心试剂管使粉末沉降至管底。将 10 μg 装量的试剂用 1 ml Neurobasal + 1x B27 培养基重悬，或将 5 μg 装量的试剂用 0.5 ml Neurobasal + 1x B27 培养基重悬，得到 10 μg/ml 储备液。使用时按 1:200 比例稀释。工作液分装后于 -80 °C 保存（例如 250 μl/管）
hiFBS	热灭活胎牛血清	-	将解冻后的 FBS 分装至 50 ml 锥形管中，在 56 °C 水浴中加热 30 分钟。完成后取出并立即将工作液分装后于 -20 °C 冻存

表2：培养基配方。

基础培养基
组分	500 ml 所需体积	稀释比例
EMEM	415 ml EMEM
15% hiFBS	75 ml hiFBS
1x Pen/Strep	5 ml Pen/Strep	1:100
2 mM Glutamine	5 ml Glutamine	1:100
*最多保存6周
分化培养基 #1
组分	50 ml 所需体积	稀释比例
EMEM	48 ml EMEM
2.5% hiFBS	1.3 ml hiFBS
1x Pen/Strep	500 μl Pen/Strep	1:100
2 mM Glutamine	500 μl Glutamine	1:100
10 μM RA	100 μl RA (5 mM 储存液)	1:500
*最多保存2周，使用前立即加入RA
*加入RA后不得额外保存培养基——RA不稳定
分化培养基 #2
组分	50 ml 所需体积	稀释比例
EMEM	49 ml EMEM
1% hiFBS	500 μl hiFBS
1x Pen/Strep	500 μl Pen/Strep	1:100
2 mM Glutamine	500 μl Glutamine	1:100
10 μM RA	100 μl RA (5 mM 储存液)	1:500
*最多保存2周，使用前立即加入RA
*加入RA后不得额外保存培养基——RA不稳定
分化培养基 #3
组分	50 ml 所需体积	稀释比例
Neurobasal	47 ml Neurobasal
1x B-27	1 ml B-27 (50X 储存液)	1:50
20 mM KCl	1 ml KCl (1 M 储存液)	1:50
1x Pen/Strep	500 μl Pen/Strep	1:100
2 mM GlutamaxI	500 μl GlutamaxI (100x 储存液)	1:100
50 ng/ml BDNF	250 μl BDNF 储存液 (10 μg/ml)	1:200
2 mM 二丁酰环磷酸腺苷 (db-cAMP)	100 μl db-cAMP (1 M 储存液)	1:500
10 μM RA	100 μl RA (5 mM 储存液)	1:500
*最多保存2周，使用前立即加入RA
*加入RA后不得额外保存培养基——RA不稳定

结果

图1：分化程序时间表。 分化过程共包括11个步骤，历时18天。在分化方案的第一天（第0天），将25,000至100,000个细胞接种到未包被的35 mm培养皿中。在第1、3和5天，移除旧培养基并加入分化培养基#1。第7天，将细胞以1:1比例传代至未包被的35 mm培养皿中，使用分化培养基#1。第8天，更换为分化培养基#2；第10天，细胞再次以1:1比例传代，但此次接种于ECM包被的35 mm培养皿中，并使用分化培养基#2。在第11、14和17天，移除旧培养基并加入分化培养基#3。第18天，已分化的神经元可用于后续实验应用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
B-27	ThermoFisher Scientific	17504-044	制备方法见表1
脑源性神经营养因子（BDNF）	Sigma	SRP3014 (10 μg)/B3795 (5 μg)	制备方法见表1
二丁酰环磷酸腺苷（db-cAMP）	Sigma	D0627	制备方法见表1
DMSO	ATCC	4-X	-
最低必需培养基伊格尔（EMEM）	Sigma	M5650	-
胎牛血清（FBS）	Hyclone	SH30071.03	制备方法见表1
GlutamaxI	Life Technologies	35050-061	-
谷氨酰胺	Hyclone	SH30034.01	-
氯化钾（KCl）	Fisher Scientific	BP366-1	制备方法见表1
MaxGel 细胞外基质（ECM）溶液	Sigma	E0282	参见实验方案第11步
Neurobasal	Life Technologies	21103-049	-
青霉素/链霉素（Pen/Strep）	Life Technologies	15140-122	-
视黄酸（RA）	Sigma	R2625	该试剂对光敏感，应避光保存于4 °C
SH-SY5Y 细胞	ATCC	CRL-2266	-
0.5% 胰蛋白酶 + EDTA	Life Technologies	15400-054	-
Falcon 35 mm TC 培养皿	Falcon (A Corning Brand)	353001	-