一种从小鼠胚胎干细胞生成神经前体细胞的技术

摘要

来源：Mao, X., 等. 小鼠胚胎干细胞体外神经元分化. J. Vis. Exp. (2020).

本视频演示了一种方法 体外 从小鼠胚胎干细胞（mESCs）生成神经前体细胞（NPCs）。将mESCs在悬浮培养中形成拟胚体（EBs），随后诱导其分化为NPCs 通过 贴壁培养中的视黄酸处理。

方案

1. 小鼠胚胎干细胞培养

1. 准备0.1%明胶包被的细胞培养皿或培养板。
   1. 向60 mm细胞培养皿中加入2 mL灭菌的0.1%明胶溶液（0.1% w/v，溶于水），轻轻摇晃以确保培养皿表面均匀包被。
   2. 将培养皿置于37 °C、5% CO₂的培养箱中，孵育1小时进行包被。
   3. 在接种细胞前移除0.1%明胶溶液。
      注意：移除明胶溶液后，无需干燥或洗涤包被过的培养皿。
2. 小鼠胚胎干细胞（A2lox和129）培养
   1. 将mESCs（A2lox和129）分别接种于0.1%明胶包被的60 mm细胞培养皿中，加入mESC生长培养基，在37 °C、5% CO₂培养箱中培养。mESC生长培养基成分为：85% Knock-out Dulbecco改良Eagle培养基/F-12营养混合物（DMEM/F12），15% Knock-out血清替代物（KSR），0.1 mM β-巯基乙醇（2ME），2 mM GlutaMAX，1%非必需氨基酸（NEAA），1%青霉素/链霉素（P/S），1000 U/mL白血病抑制因子（LIF），10 nM CHIR-99021（GSK-3抑制剂）和0.33 nM PD0325901（MEK抑制剂）。
      注意：β-巯基乙醇易燃，且具有吸入毒性。使用时应远离火源，并佩戴口罩以避免吸入。
   2. 每天更换mESC生长培养基，以促进A2lox和129细胞的良好生长。
   3. 当细胞融合度达到80%时，吸除培养基，向培养皿中加入1 mL 0.1%胰蛋白酶，轻轻摇晃30秒，确保胰蛋白酶均匀覆盖所有细胞。
   4. 胰蛋白酶消化约1分钟后，用1 mL移液器吸除胰蛋白酶。
   5. 向培养皿中加入2 mL mESC生长培养基，反复吹打数次，制成单细胞悬液。
   6. 使用血细胞计数板尽可能准确地测定细胞悬液中的细胞密度。
   7. 将细胞分为7组，并根据表1所示的不同方案诱导分化。

2. 从 mESC 分化为 NPC

1. 准备0.1%明胶包被的细胞培养板或盖玻片。
   1. 使用前，按照步骤1.1的方法制备0.1%明胶包被的6孔板或盖玻片。
2. 分化（表1）
   1. 将1.5 × 10⁶个mESC接种至非黏附性细菌培养皿中，加入10 mL基础分化培养基I，于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育，以诱导胚状体形成。
   2. 2天后，将细胞聚集体转移至15 mL离心管中，静置沉降。
   3. 吸除上清液，加入10 mL新鲜的基础分化培养基I重悬胚状体，重新接种至新的非黏附性细菌培养皿中，继续分化2天。
   4. 在显微镜下观察胚状体的形成情况（图1A）。
   5. 按照步骤2.2.2–2.2.3所述方法收集胚状体，将约50个胚状体接种至每孔2 mL基础分化培养基I中，接种于0.1%明胶包被的6孔板中。
   6. 配制1 mM全反式维甲酸（RA）储存液（溶于DMSO），分装后避光保存于-80 °C冰箱中。
      注意：RA不稳定，在配制储存液时应注意避光并尽量减少与空气接触。
   7. 进行RA诱导时，每孔加入2 µL RA储存液，使终浓度为1 µM。
   8. 将培养板置于37 °C、5% CO₂培养箱中继续分化4天。
   9. 每2天更换一次全部2 mL基础分化培养基I（含1 µM RA）。

表1：分化方案使用细节。

实验方案	培养基
4天类胚体形成 + 4天视黄酸诱导	基础分化培养基： DMEM/F12 +15%FBS + 1%NEAA + 0.1mM 2ME + 1%P/S

结果

图1：类胚体的形态学特征。（A）培养4天的类胚体。（B）培养2天的类胚体。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
B-27 添加剂（50倍浓缩），无血清	Gibco	17504044	于 -20 °C 保存，避光
CHIR-99021 (CT99021)	Selleck	S1263	于 -20 °C 保存
盖玻片	NEST	801007
胎牛血清	HyClone	SH30084.03	于 -20 °C 保存，避免反复冻融
明胶	Gibco	CM0635B	室温保存
GlutaMAX 添加剂	Gibco	35050061	于 4 °C 保存
KnockOut DMEM/F-12 培养基	Gibco	12660012	于 4 °C 保存
KnockOut 血清替代物	Gibco	10828028	于 -20 °C 保存，避免反复冻融
MEM 非必需氨基酸溶液	Gibco	11140076	于 4 °C 保存
N-2 添加剂（100倍浓缩）	Gibco	17502048	于 -20 °C 保存，避光
Neurobasal 培养基	Gibco	21103049	于 4 °C 保存
磷酸盐缓冲液（1倍浓度）	HyClone	SH30256.01B	于 4 °C 保存
青霉素/链霉素溶液	HyClone	SV30010	于 4 °C 保存
PD0325901 (Mirdametinib)	Selleck	S1036	于 -20 °C 保存
维甲酸	Sigma	R2625	于 -80 °C 保存，避光
129 品系小鼠胚胎干细胞	Cyagen	MUAES-01001	在无饲养层培养体系中维持
0.25% 胰蛋白酶（1倍浓度）溶液	HyClone	SH30042.01	于 4 °C 保存
2-巯基乙醇	Gibco	21985023	于 4 °C 保存，避光
60 mm 细胞培养皿	Corning	430166
15 ml 离心管	NUNC	339650