神经前体细胞向神经元的分化

摘要

来源：Mao, X., 等. 小鼠胚胎干细胞体外神经元分化. J. Vis. Exp. (2020)。

该视频展示了一种将神经前体细胞分化为神经元的细胞培养方法。通过在添加了生长因子的富含营养的培养基中孵育细胞，前体细胞成熟为具有发育良好的轴突和树突的神经元。一种稳定剂可确保细胞在整个分化过程中的存活率，并防止氧化损伤。

方案

1. 从NPCs向神经元的分化（第二阶段）

1. 将约 5 × 10⁵ 个鼠胚胎干细胞（mESC）或其分化衍生物接种于每孔 2 mL 基础分化培养基 I 中，接种至 0.1% 明胶包被的 6 孔板中。将 mESC 分化衍生物随机分为 3 组，分别对应第二阶段方案 1、方案 2 和方案 3。
2. 将培养板置于 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中孵育 6 小时，使细胞贴壁，随后用 2 mL PBS 洗涤两次。
3. 分别向上述各组的每孔中加入 2 mL 基础分化培养基 I、N2B27 培养基 I 和 N2B27 培养基 II （表 1）。
4. 将培养板放回培养箱中，继续分化培养 10 天，每 2 天更换相应的培养基。
5. 观察分化状态，并记录如步骤 3 所述的形态学变化。
6. 在第 18 天，评估神经元（β-Tubulin III 阳性）的生成情况，并确定步骤 4 中使用的 3 种方案的分化效率。

结果

表1：第二阶段分化中使用的3种方案的详细信息。

分化阶段 II（10天）
	方案	培养基
方案 1	自然分化：仅使用基础分化培养基 I	基础分化培养基 I：DMEM/F12 + 15% FBS + 1% NEAA + 0.1 mM 2ME + 1% P/S
方案 2	使用 N2B27 培养基 I 进行分化	N2B27 培养基 I：DMEM/F12 ...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
兔抗 β-微管蛋白 III 抗体	Sigma Aldrich	T2200	保存于 -80 °C，避免反复冻融
B-27 补充剂（50X），无血清	Gibco	17504044	保存于 -20 °C，避光
DME/F-12 1:1（1x）	HyClone	SH30023.01B	保存于 4 °C
胎牛血清	HyClone	SH30084.03	保存于 -20 °C，避免反复冻融
荧光显微镜	Olympus	CKX53
明胶	Gibco	CM0635B	室温保存
GlutaMAX 补充剂	Gibco	35050061	保存于 4 °C
免疫染色一抗稀释缓冲液	Beyotime	P0103	保存于 4 °C
KnockOut DMEM/F-12	Gibco	12660012	保存于 4 °C
MEM 非必需氨基酸溶液	Gibco	11140076	保存于 4 °C
N-2 补充剂（100X）	Gibco	17502048	保存于 -20 °C，避光
正常山羊血清	Jackson	005-000-121	保存于 -20 °C
Neurobasal 培养基	Gibco	21103049	保存于 4 °C
非粘附性细菌培养皿	Corning	3262
磷酸盐缓冲液（1X）	HyClone	SH30256.01B	保存于 4 °C
青霉素/链霉素溶液	HyClone	SV30010	保存于 4 °C
PD0325901（Mirdametinib）	Selleck	S1036	保存于 -20 °C
视黄酸	Sigma	R2625	保存于 -80 °C，避光
129 品系小鼠胚胎干细胞	Cyagen	MUAES-01001	维持于无饲养层培养体系中
2-巯基乙醇	Gibco	21985023	保存于 4 °C，避光
4% 多聚甲醛	Beyotime	P0098	保存于 -20 °C
6 孔板	Corning	3516
60 mm 细胞培养皿	Corning	430166
15 ml 离心管	NUNC	339650