从感觉神经节中分离细胞

摘要

来源：Kaelberer, M. M.，等。一种靶向并分离小鼠气道支配感觉神经元的方法。J. Vis. Exp. (2016)。

本视频展示了从小鼠感觉神经节中分离细胞的方法。首先对神经节进行酶消化处理，以降解细胞外基质。随后通过细胞滤网过滤获得单细胞悬液，并利用密度梯度离心法去除碎片杂质。最后通过洗涤和离心，收集分离得到的细胞，用于后续分析。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 感觉神经节解离

1. 用移液器吸出500 µl神经节解离液（GaDS）（表1），保留神经节在管中。加入1 ml磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤神经节一次，等待神经节沉降至管底，然后吸除PBS。
2. 向每管中加入1 ml GaDS和22 µl消化酶（I/II型胶原酶与蛋白酶混合物，溶于水，浓度为2.5 mg/ml）。
3. 向阳性对照管中加入20 µl Fast Blue（5.26 mM）。
4. 将各管放入设定为37 °C的水浴锅或加热金属块中。
5. 每隔15分钟，轻轻振荡并弹动试管，确保神经节被溶液充分覆盖。
   注意：神经节的消化时间取决于消化酶的使用时间。消化酶溶解后一个月内使用时，消化30分钟；2至6个月内使用时，消化45分钟；若酶已使用超过六个月，则消化60分钟。
6. 在神经节消化过程中，使用颗粒溶液（聚乙烯吡咯烷酮包被的胶体二氧化硅颗粒）制备密度梯度。
7. 将12%颗粒溶液与GaDS混合，每份样品500 µl。
8. 将28%颗粒溶液与GaDS混合，每份样品500 µl。
9. 在新的1.5 ml离心管中，缓慢而小心地将400 µl 12%密度溶液加至400 µl 28%密度溶液之上。避免两层溶液混合。管中应可见两层清晰分界、颜色深浅不同的液体。
10. 达到适当消化时间后，吸除含消化酶的GaDS，并用1 ml PBS洗涤神经节两次。每管中加入200 µl新鲜GaDS。
11. 使用设定为100 µl体积的200 µl移液器，反复吹打神经节数次以分散细胞。重复操作直至无完整组织块可见。避免在溶液中产生气泡。
12. 将解离后的细胞通过70 µm细胞筛网过滤。
13. 向原始解离管中再加入100 µl GaDS，以收集残留的游离细胞，并将额外溶液通过细胞筛网。使用新的移液器吸头，收集已通过筛网并附着在筛网上的含细胞液体。最终悬浮于GaDS中的细胞体积为300 µl。
14. 小心地将300 µl细胞悬液叠加至先前制备的密度梯度之上。避免产生气泡以及细胞与密度层之间的混合。
15. 在室温下以2,900 × g离心10分钟。
16. 离心完成后，小心吸除并弃去上层700 µl液体。该层含有大部分细胞碎片，若不除去将干扰后续细胞分选。
17. 向剩余含细胞的溶液中加入700 µl新鲜GaDS，并反复吹打数次以混匀。
18. 18. 在2,900 × g下离心15分钟以沉淀细胞。
19. 19. 离心结束后，小心吸除并弃去上清液，保留细胞沉淀。
20. 使用设定为200 µl的1,000 µl移液器反复吹打，将细胞沉淀重悬于200–300 µl GaDS中。将样品置于冰上。

表1. 神经节解离液（GaDS）的试剂混合物。

成分	用量
Advanced DMEM/f12	9.5 ml
谷氨酰胺（glutamine）	100 µl
HEPES (10 mM)	100 µl
N2 补充剂（N2 supplement）	100 µl
B27（不含维生素A）	200 µl
NGF (50 µg/ml)	10 µl

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
杜尔贝科氏磷酸盐缓冲液（PBS），无钙无镁	Gibco	14190-144
高级 DMEM/F12 培养基	Gibco	12634-010
谷氨酰胺（Glutamax）	Gibco	35050-061
HEPES	Gibco	15630-080
N2	Gibco	17502-048
B27（不含维生素 A）	Gibco	12587-010
神经生长因子（NGF）	Sigma	N6009	储存液：50 µg/ml 溶于 PBS/10% FBS
消化酶，Liberase DH 研究级	Roche	5401054001	储存液：2.5 mg/ml 溶于水
颗粒溶液（Percoll）	Sigma	P1644-25ML
加热金属块	LabNet
70 µm 细胞滤网	Falcon	352350