一种改良的滚筒管法用于啮齿类动物脑切片的长期培养

摘要

来源：Fixman, B. B.，等。封闭系统中脑片长期培养期间实现精确定位与重复间歇成像的改良滚筒管法。J. Vis. Exp. （2017）。

本视频展示了一种改良的滚筒培养管法，用于长期培养啮齿类动物模型的脑切片。首先，将脑切片固定在盖玻片上。然后，取带有平面侧壁且在平面一侧开孔的滚筒培养管，使用粘附圆盘将盖玻片固定于管壁的孔上。最后，向管内加入营养培养基以及二氧化碳与空气的混合气体，并将培养管置于滚动装置中进行孵育。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

注意：以下方案描述了用于长期孵育和间歇成像的海马脑片的制备与培养方法。将单个海马脑片通过血浆凝块固定在特制的光刻蚀盖玻片上，随后将盖玻片密封至一端被钻通的滚筒培养管的平面端，再将滚筒管置于滚筒式培养箱中进行培养。

1. 滚管架的准备

1. 使用按比例尺所示尺寸打印的 图1A 模板。用钉子在模板上每个孔的中心位置穿出小孔（孔径需足够插入细头记号笔）。
2. 将模板置于一个直径为15 cm的组织培养皿（标称直径14 cm）底部，标记出孔的位置。对第二个培养皿重复此操作。
3. 使用适用于塑料材料的钻头，在每个培养皿底部以六边形阵列方式钻出六个直径为1.5 cm的孔（孔中心间距为4.8 cm，距培养皿边缘2.5 cm）。在两个大孔之间等距位置，距边缘12 mm处钻出三个直径为3 mm的小孔，如 图1A 所示。
4. 将两个培养皿的底部相对放置，从其中一个较小的孔中插入一根长2.5英寸、直径3/16英寸的机械螺钉，并依次加装一个平垫圈、一段聚乙烯管（作为间隔垫，长4.7 cm）、另一个平垫圈、第二个组织培养皿、另一个平垫圈、一个锁紧垫圈，最后拧上螺母。
5. 对另外两根机械螺钉重复步骤1.4的操作，先松紧固定，待所有螺钉均安装到位后再将螺母完全拧紧。
6. 将护孔圈（厚5/16英寸，内径5/8英寸）压入底部培养皿的孔中，组装成最终的滚瓶架（见图1B，图中已放置两个滚瓶）。在每个滚瓶架上贴上带有唯一编号的标签。

2. 滚管与盖玻片的制备

1. 制作用于在滚轴管上钻孔的夹具
   1. 在一块 2 x 4 x 5.5 英寸的木块侧面中心处，以一定角度钻一个直径 1.5 cm、深 8 cm 的孔，使得插入滚轴管后其平面侧几乎与木块平行（图 2A）。
   2. 使用圆形木锉扩大该孔，同时拓宽并修整孔的锥度，以便插入管子（滚轴管靠近管帽端的直径略大）（图 2B）。
   3. 在距离木块侧面 5.5 cm 处钻一个直径 1.5 cm 的垂直孔，并使其位于侧孔正上方中心位置（图 2C）。
   4. 当侧孔已充分修整成锥形后，插入一根在目标位置已做标记的滚轴管，使切片所需孔位居中，并将管子调整至标记点位于 1.5 cm 垂直孔的中心。
   5. 取出管子，测量标记点至管端的距离。在夹具上从孔中心量出相同距离并钉入一根钉子，作为钻孔时定位管子的限位挡块（图 2C 中的箭头所示）。
   6. 使用钢锯将钉子剪切至与木块表面齐平，以防造成伤害。
   7. 若钻床带有可固定夹具的槽口，则在夹具底部加装弹簧夹（图 2D 黑色箭头）；否则使用 C 型夹将夹具牢固固定在钻床上。
2. 使用上述夹具固定并定位一个平面朝上的 11 cm 平面塑料培养管（图 2A），在距管底 1.0 cm 处、管壁两侧之间中心位置钻一个直径 6 mm 的孔。
   注意：应使用专为塑料设计的钻头。
3. 使用旋转去毛刺工具修整孔的边缘（图 2E），并在孔内侧边缘制作 4 条凹槽（图 2E，插图），以利于旋转过程中液体排出。
4. 使用 12 mm 打孔器从无毒双面粘性硅橡胶片上切下直径 12 mm 的圆片。使用标准单孔打孔器（直径 6 mm）在每个圆片中心打孔。
5. 用 70% 乙醇冲洗钻孔后的培养管，在生物安全柜中晾干，并将培养管和打孔粘性圆片置于紫外灯（平均距离 70 cm，功率 30 W）下照射 40 分钟进行灭菌。
6. 20 分钟后重新调整管子和圆片的位置，确保所有暴露表面均被灭菌。在无菌条件下，撕下粘性圆片的白色背衬，将硅橡胶贴附于培养管外侧，使两者的孔对齐（图 2F）。
   注意：为避免紫外线暴露，开启紫外灯前应佩戴护目镜并关闭柜门。
7. 清洗直径 12 mm 的光蚀刻德国玻璃盖玻片（中心编号，每格 1 mm²，共 100 格）。用镊子轻轻夹持盖玻片，依次浸入无水乙醇、水、无水乙醇，最后在火焰上灼烧以去除残留乙醇。待盖玻片冷却。
8. 用镊子夹持盖玻片，浸入含 2% 3-氨基丙基三乙氧基硅烷的丙酮溶液中 10 秒。用超纯水冲洗盖玻片，然后自然晾干。
9. 将盖玻片置于生物安全柜内的无菌滤纸上，打开紫外灯，每侧各照射 20 分钟。
   注意：为避免紫外线暴露，开启紫外灯前应佩戴护目镜并关闭柜门。

3. 海马脑片制备

1. 开始解剖前，准备双刃剃须刀片的一半用于组织切片机。用手小心地沿长度方向对折刀片，然后折断成两半。
2. 使用棉签蘸丙酮清洗刀片的一半，随后用无水乙醇冲洗，并在空气中晾干。在将刀片的一半安装到组织切片机之前，用70%乙醇冲洗以进行灭菌。
3. 遵循机构动物护理与使用委员会批准的方案；在异氟烷麻醉后，通过断头法处死一只出生4至7天的小鼠或大鼠幼崽，并用剪刀或断头器移除头部。
   注意： 脑片培养方案与小鼠或大鼠品系或基因型无关。已使用多种不同遗传背景的转基因小鼠品系。
4. 用70%乙醇冲洗头部，并将其放入60 mm的培养皿中。从此时起直至最终将脑片安装到滚筒管上，所有后续步骤均需在层流罩内进行，以保持无菌状态。
5. 使用#21外科刀片，在皮肤和颅骨上做矢状切口。用#5 Dumont镊子向后剥离皮肤和颅骨，以暴露脑组织。
6. 闭合镊子，轻柔地分离整个脑组织，通过镊子夹住小脑后方的脑干部位将其释放。将脑组织放入含有4 °C Gey's平衡盐溶液/0.5%葡萄糖（GBSS/葡萄糖）的无菌60 mm培养皿中。
7. 在解剖显微镜下观察脑组织（图3A），将脑组织背侧朝上放置，用外科刀片切除脑前部三分之一和小脑（图3B）。
   1. 用镊子夹住修剪后的脑组织，使其后侧朝上，腹侧紧贴培养皿侧壁以保持稳定。用尖头精细的Dumont #5镊子轻轻剥离矢状中线周围的软脑膜，并移除中脑组织（图3C，虚线圆圈）。
   2. 沿脑组织两侧各做一次切口，使其展开（图3C，虚线）。当脑组织背侧朝下并完全展开后，应可见海马裂（图3D，箭头）。
   3. 将展开的脑组织转移至一片聚三氟氯乙烯塑料膜上，并将其定位在组织切片机的平台上以进行切片。用GBSS/葡萄糖润湿刀片，将海马切成约300 µm厚的切片。
   4. 用移液器将切好的脑组织从塑料膜上冲洗至另一新鲜的含有GBSS/葡萄糖的60 mm培养皿中（图3E）。用尖头精细镊子轻轻夹取并剥离切片上残留的软脑膜及其他非海马组织（图3F）（图3G、H）。

4. 切片铺板

1. 获得切片后，将 2 µL 鸡血浆置于已制备的盖玻片光蚀刻面的中央。轻轻涂抹血浆，使其形成直径为 3–4 mm 的斑点。
   注意： 当通过解剖显微镜观察时，光蚀刻面为盖玻片的上表面，此时数字朝向正确。
2. 使用无菌细头刮铲（图 4A）将 1 个脑切片转移至血浆斑点（图 4B）。用闭合的镊子夹住切片，使其固定在刮铲尖端，同时从 GBSS/葡萄糖溶液中提起切片。
3. 将刮铲接触盖玻片上的血浆斑点，并用闭合的镊子将切片推至盖玻片表面。
4. 在另一管中混合 2.5 µL 血浆与 2.5 µL 凝血酶。迅速取 2.5 µL 该混合液覆盖并围绕切片，轻轻吹打混匀（图 4B）。
   注意： 血浆将在 10–15 秒内凝固，因此操作必须迅速。若切片黏附困难，可将 5 µL 血浆与 5 µL 凝血酶混合，取 4–5 µL 加于切片上，混匀后吸除部分液体，使切片平整贴附于盖玻片。
5. 移除先前固定在滚轴管上的硅橡胶黏合剂暴露侧的透明塑料覆盖层，将带有脑切片的盖玻片置于黏合剂上，使切片对准孔洞位置（图 4C）。
6. 为确保牢固黏附，在将盖玻片转移至生物安全柜的过程中，用拇指均匀轻压盖玻片表面，持续按压约 1 分钟。
7. 在生物安全柜内，向每根管中加入 0.8 mL 完全 Neurobasal A 培养基（材料表）（图 4D）。
8. 通过夹具固定带有无菌棉塞的巴斯德移液管，通入 5% CO₂/95% 空气混合气体。用该气体冲洗滚轴管，随后迅速拔出移液管并立即盖紧管帽。
9. 在管壁上标记切片编号和架子编号。将管插入滚轴架中，确保其几何分布平衡。若管数为奇数，需添加空管以保持平衡。
10. 将架子放入 35 °C 滚轴培养箱中，调节滚轴使滚轴架以约每小时 10–13 转（RPH）的速度旋转（图 4E）。为使培养基始终位于管底，可用木板垫高培养箱前部，使其向后倾斜约 5°。

结果

图 1： 滚管架的制备。（A）用于标记在15 cm组织培养皿底部钻孔位置的模板。若将该图按所示比例尺大小打印，可将其剪下并用于在15 cm培养皿上标记需钻孔的位置。（B）已插入两根滚管的完整滚管架。每个架子顶部均贴有编号标签，便于识别。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 cm 培养皿底部	VWR Scientific	25384-326
十字槽盘头机螺钉（#10-32）	Ace Hardware		2.5" 长，直径 3/16"
平垫圈 #10	Ace Hardware
机螺母（#10-32）	Ace Hardware
橡胶护圈	Ace Hardware		厚度 5/16"，孔径 5/8"，外径 1.125"
聚乙烯管（5/16" 外径，3/16" 内径）	Ace Hardware		切成 1.8" 长度
锁紧垫圈 #10	Ace Hardware
台式钻床，5 速	Ace Hardware
Nunclon Delta 平侧管	VWR	62407-076
钻头，3 mm、6 mm 和 15 mm	Ace Hardware	Diablo freud 品牌	用于切割塑料的钻头
木工钻头，1.5 cm 和 1 mm	Ace Hardware
1/4" 圆形木工锉	Ace Hardware
弹簧夹，16 mm 卡扣式	Ace Hardware
万向头去毛刺工具，5"	Ace Hardware	26307
粘性硅胶片（Secure Seal）	Grace Bio-Labs	666581	厚度 0.5 mm
6 mm 打孔器	Office Max
12 mm 打孔器	thepunchbunch.com
70% 乙醇
光刻盖玻片，直径 12 mm	Bellco Glass, Inc.
本生灯
无水乙醇
纳米纯水
3-氨基丙基三乙氧基硅烷	Sigma-Aldrich	A3648
丙酮	Sigma-Aldrich	179124
#5 Dumont 镊子	Fine Science Tools	11251-30
McIlwain 组织切片机	Ted Pella, Inc.	10180
双刃剃须刀片	Ted Pella, Inc.	121-6
Whatman 滤纸	VWR	28450-182	裁成直径 5.8 cm 的圆片
聚氯三氟乙烯（Aclar）	Ted Pella, Inc.	10501-10	裁成直径 5.8 cm 的圆片
#21 外科刀片	VWR Scientific	25860-144
#5 Dumont 镊子	Fine Science Tools	11251-30
不锈钢刮勺，锥形末端	VWR	82027-518
Gey's 平衡盐溶液	Sigma-Aldrich	G9779
葡萄糖	ThermoFisher Scientific	15023-021	25% (w/v) 溶液，0.2 mm 滤膜除菌
鸡血浆	Cocalico Biologicals	30-0300-5L	用无菌水重悬，4 °C 下以 2500 × g 离心 30 分钟，分装后迅速在液氮中速冻，并于 -80 °C 保存。
凝血酶，外用（牛源）	Pfizer	Thrombin-JMI	用提供的稀释液配制成 1,000 国际单位/mL，分装后迅速在液氮中速冻，并于 -80°C 保存。使用浓度为 250 单位/mL。
细胞滚瓶系统	Bellco Biotech	SciERA
滚筒培养箱	Forma	Model 3956