启动快速神经突延伸及功能性神经元连接的形成

摘要

来源：M. H. Magdesian 等，《重新连接神经回路：一种快速神经突延伸与功能性神经元连接的新方法》，J. Vis. Exp. (2017)，https://app.jove.com/v/55697

本视频展示了一种利用微流控装置和显微操作技术快速启动神经元生长、延伸并建立与目标神经元新连接的方法。该技术可用于旨在修复创伤后或神经退行性疾病中神经元环路连接的治疗策略。

方案

1. 使用微流控装置标准化神经元培养：装置组装

1. 为所需的实验选择合适的微流控装置。为了连接同一群体内的神经元，请使用神经元装置（Neuro Devices）图1），并使用共培养装置（Co-Culture Devices）连接不同群体的神经元，图2).
2. 清洁并准备所需数量的无菌盖玻片或玻璃底培养皿。在塑料表面培养时，建议使用35 mm培养皿；在玻璃表面培养时，建议使用25 mm盖玻片或35 mm玻璃底培养皿。根据成像系统选择合适的玻璃厚度，例如0.15 mm。
3. 用 0.5–1 mL 浓度为 100 µg/mL 的 PDL 在室温下孵育 2 小时或过夜，以包被培养皿或盖玻片。
   注意： 此处可暂停实验方案，必要时于次日继续。此外，培养皿可用硼酸盐缓冲液稀释的PDL、Poly-L-Lysine（PLL）、层粘连蛋白（laminin）或任何其他细胞黏附分子进行包被。
4. 用清水洗涤培养皿两次（不要使用磷酸盐缓冲液（PBS），因为盐晶体可能会堵塞通道），移除所有液体，并在无菌环境（如生物安全柜）中干燥5-10分钟，或直至表面完全干燥。
   注意： 务必确保盖玻片完全干燥，因为残留的液体会影响微流控系统的黏附。
5. 将微流控装置的图案面朝上置于无菌环境（生物安全柜）中的紫外光下照射10分钟。在生物安全柜内操作时，务必遵循无菌操作规程。
6. 使用镊子将微流控装置的图案面朝下放置，使其与洁净的盖玻片/培养皿接触。用镊子轻轻按压装置，使其粘附在玻璃表面。
   注意： 透过光线可观察到粘附区域的透明度。确保所有角落均与玻璃接触。对所有微流控装置进行此操作。参见 图1a.
7. 为将单一群体培养装置加满培养基，将移液枪头对准通道，向右上角的孔中加入50 µL完全细胞培养基，该培养基需添加无血清B-27（体积比1:50）以及500 µg/mL青霉素/链霉素/谷氨酰胺（统称为NBM）；然后向其对角线方向的孔中再加入50 µL培养基。对所有装置重复此操作，并确保培养基在孔之间流动。随后，向剩余的两个孔中各加入50 µL培养基。参见 图3a。
   1. 将移液管对准通道，向右侧孔中加入30 µL完全NBM培养基，以填充多群体装置，参见 图2a对所有装置进行此操作，确保培养基在孔之间流动。接着，向剩余的四个孔中各加入 50 µL 培养基。
8. 将设备放入一个较大的培养皿中，内放一个装有经高压灭菌水的开放式培养皿（湿润 chamber），然后置于培养箱中（37 °C，5% CO₂）_2, 并在准备细胞培养时，在37°C、5% CO₂及95%湿度条件下孵育1-2小时。参见 图3b.

2. 在微流控系统中接种神经元

1. 按照实验方案，从 Sprague Dawley 大鼠胚胎（无论性别）中获取解离的海马或皮层神经元。
2. 将胚胎神经元重悬于 NBM 中，浓度为 1–2 × 10⁶ 个神经元/mL。使用血细胞计数板在显微镜下验证细胞浓度，并参照文献8。根据所需的细胞密度调整细胞浓度。为提高每个通道获得单根海马轴突的概率，每台设备接种 10,000 个神经元；若希望在同一通道中存在多根轴突，则每台设备接种 60,000 个神经元。
   注意：这些数值会因所用神经元类型的不同而有所变化。
3. 从微流控装置中移除培养基，但不要抽干小室，每个小室中保留约 5 µL。
4. 在单一群体装置中接种细胞时，向右下孔加入 50 µL NBM。此时培养基会自动流动并填充另一个下孔。然后，将 20 µL 浓缩细胞悬液加入微流控装置的右上孔，如图 1b所示。
   1. 在多群体装置中接种细胞时，将 20 µL 浓缩细胞悬液分别加入图 2a中所示的各个右孔。
5. 在显微镜下检查细胞是否已进入小室，并将装置放入培养箱中孵育 15–30 分钟，以促进细胞贴附于基质。
6. 在显微镜下检查小室中细胞数量是否充足。若不足，重复步骤 2.4 和 2.5。
7. 向单一群体装置的两个上孔各加入 50 µL NBM，向多群体装置中已注入细胞的同一孔加入 20 µL NBM。此时液体略微凸出，形成正弯月面，使小孔呈现“松饼顶”状外观。参见图 3a。
8. 将细胞维持在 37 °C、5% CO₂ 和 95% 湿度的培养环境中。

3. 神经元培养物的维持

1. 在细胞接种至装置后的第二天（即步骤2后的第1天），用移液器从细胞中移除约30 µL的NBM，并加入新鲜预热的NBM。
2. 每2天检查一次每个通道中的培养基是否充足。若“muffin top”（液面凸起）较低，只需向顶部孔中补充更多培养基即可。
3. 在移除微流控装置前，至少培养细胞7天。细胞可在这些装置中存活数周。在对样品进行实验前1-2天移除装置。

4. 微流控装置的移除

1. 在移除微流控装置前 1 至 2 天，向每个样品培养皿中加入 2 mL 预热至 37 °C 的 NBM，淹没各腔室，并将装置继续置于培养箱中维持培养。
2. 使用无菌镊子和一个移液枪头，将微流控装置从盖玻片上移除，从而留下神经元的图案化排列。操作时用枪头固定盖玻片，用镊子夹住装置左下角边缘，轻柔施加扭转力，用镊子将装置缓缓提起，使其从盖玻片上剥离。参见 图 3c-3d。
3. 每 2 至 3 天更换一半 NBM，直至样品用于实验。
4. 在对样品进行神经回路重连实验前，需通过显微镜检查单一群体装置通道中的神经突以及多群体装置中各神经元群体之间的间隙，确认其相互隔离，确保无任何纤维连接不同神经元群体。

5. 制备PDL包被的微珠

1. 向1 mL PDL（100 µg/mL）中加入两滴50 µL的4、10或20 µm聚苯乙烯微球水溶液（按1:500稀释）。室温孵育至少2小时。
   注意：此处可暂停实验流程，次日继续操作。
2. 以8,820 × g离心1分钟。小心移除上清液，避免扰动容器底部聚集的微球。
3. 用1 mL无菌HEPES溶液（10 mM，pH 8.4）洗涤微球两次。
4. 将PDL包被的微球重悬于200 µL的10 mM HEPES溶液（pH 8.4）中。

6. 制备微量移液器

1. 使用水平电极拉制仪从玻璃毛细管（内径 1 mm，外径 1.5 mm）制备移液管。调节参数，使拉制后的微移液管尖端外径约为 2–5 µm。拉制前确保玻璃管清洁。
2. 将移液管固定于载玻片上以储存，并确保尖端不接触载玻片表面，以免损坏脆弱的尖端。置于室温下带盖容器中保存，以防灰尘污染。移液管应在拉制当天使用。

7. PDL-微珠与神经元的黏附

1. 将步骤5中制备的40–60 µL多聚-D-赖氨酸包被的微珠加入步骤4中制备的细胞培养物中。将移液器吸头置于盖玻片上隐约可见的神经元正上方，加入微珠（见图4）。
2. 将样品放回培养箱中孵育1小时，以促进突触连接的形成。
3. 孵育结束后，用预热的神经元基础培养基（NBM）轻轻洗涤培养物，去除未黏附的微珠。

8. 制备生理盐水溶液（用于室温实验）

1. 制备生理盐水溶液，用于调节细胞环境 外部 培养箱
2. 验证渗透压和pH值。
3. 持续用 O 溶液灌注₂ 以尽量减少实验过程中的pH波动。
4. 加热至室温。
5. 通过将一根塑料管的一端（可选尺寸）插入 O 中，搭建灌流系统₂注入生理溶液，并将另一端固定在插入样品 holder 中的针头上。将管路和溶液置于样品上方 （见图5）。
   1. 将管路从针头断开，并连接至注射器。使用注射器施加压力并抽吸液体，使管路充满。用滚轮夹封闭管路，重新连接针头。

9. 珠子微操作

1. 将样品安装在实验装置中，使细胞能够从上方通过安装在显微操作器上的两根微管尖端进行操作，同时从下方通过倒置光学显微镜的40倍相差物镜（数值孔径0.6）进行光学观察。在此配置下，将CCD相机连接至显微镜的侧端口以用于图像采集。通过塑料管将每根微管连接至1 mL注射器。在此步骤中，用生理盐水溶液（1–2 mL）替换NBM（参见图5）。
2. 实验过程中，以0.5–1 mL/min的流速持续灌注步骤8中制备的生理盐水溶液。
3. 在视野中选择一个未与神经元连接的PDL微珠。通过显微镜对微珠进行调焦，然后调整至微管尖端，使其与微珠对齐。通过显微镜观察，将微管尖端尽可能下移至接近微珠的位置。
4. 使用连接微管的1 mL注射器施加负压，以吸取微珠。在整个实验过程中保持负压状态。

10. 牵拉神经突

1. 在视野中选择一个连接到神经元的PDL微珠，并使用负压将其连接到第二根微移液管上，操作方法如步骤9.3-9.4所述。
2. 缓慢拉动PDL-微珠-神经元复合体（约0.5 µm/min），通过移动显微操作器或样品台移动1 µm，暂停5分钟，以允许神经突起始。
3. 重复步骤10.2两次。
   注意：前3 µm必须非常缓慢地拉伸，以确保实验成功，成功率超过95%。
4. 通过缓慢（约0.5 µm/min）移动显微操作器或样品台2 µm，继续拉动PDL-微珠-神经元复合体，并暂停5分钟，以促进神经突延伸。
5. 在成功完成前5 µm的神经突起始和延伸后，以20 µm/min的速度在毫米级距离上持续拉动神经突。
   注意：拉伸操作可连续进行，也可分步进行，并可采用不同速率。参见图6b-6c。

11. 连接神经元

1. 选择一个富含神经突的区域，并将 PDL-微珠-神经突复合物降低，使其与该区域发生物理接触。使用其他微珠来判断微珠尖端相对于盖玻片表面的高度。参见 图6d。
2. 在操作第二根微移液管时，保持 PDL-微珠-神经突复合物与目标神经突的接触状态。将带有第二个 PDL-微珠的第二根移液管下移，置于新形成的神经突上方，距离第一个微珠约 20 µm 处。利用第二个 PDL-微珠将新生神经突纤维推向目标细胞。
3. 将两个微珠固定至少 1 小时。通过显微镜观察确认无局灶性肿胀现象，即神经突与微珠接触部位未出现增粗16。
4. 在此期间，通过灌流缓慢将样品的生理盐水更换为预热并经 CO₂ 平衡的 NBM 培养基。
5. 通过释放负压使第二根移液管上的微珠脱离。若新生神经突仍保持连接，则同时释放第一个微珠。参见 图6e。
6. 轻柔移除盐溶液，并替换为 NBM（约 2 mL）。
7. 小心将样品放回培养箱，以增强神经元连接，为后续实验做准备。该连接可稳定维持 >24 小时。

结果

图1：利用微流控装置标准化神经元培养7。（a）装置组装：将微流控装置正确组装在干燥表面上时，所有腔室均可见。（b）细胞接种：将细胞接种于右上侧孔中，细胞应向左侧孔移动。（c）细胞密度：接种后立即在显微镜下检查细胞浓度是否合适。（d）培养1天后，海马神经元已良好贴附于微通道附近，并开始形成神经突。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
神经设备	Ananda Devices		可从 http:// www.anandadevices.com 购买
1 号圆形玻璃盖玻片，直径 25 mm	Warner Instruments	64-0705
35 mm 细胞培养皿，无热原，无菌	Corning Inc	430165
95 mm × 15 mm 培养皿，可滑动盖，无菌聚苯乙烯	Fisherbrand	FB0875714G
Neurobasal 培养基	Life Technologies	21103-049	细胞外溶液
B-27 添加剂（50X），无血清	Thermo Fisher Scientific	17504044	细胞外溶液
青霉素、链霉素、谷氨酰胺	Thermo Fisher Scientific	11995-065	细胞外溶液
2 – 20 μL 移液器，抗气溶胶吸头	Thermo Fisher Scientific	2149P
Dumont Dumostar 镊子，11 cm	World Precision Instruments	500233
解剖工具	Braun, Aesculap
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐	Sigma-Aldrich	P6407
基于聚苯乙烯的微粒，10 μm	Sigma-Aldrich	72986
水平移液管拉制仪	Sutter Instruments	Brown-Flaming P-97
显微操作器，PCS-5000 系列 MC7600R	SD Instruments	MC7600R
1 mL 注射器	BD Luer-Lok	309628
倒置显微镜	Olympus	IX71
物镜 UIS2	Olympus	LUCPLFLN 40X
CCD 相机	Photometrics	Cascade II: 512