通过重编程人皮肤成纤维细胞生成神经元

摘要

来源：Shrigley, S.，等。由人成年皮肤成纤维细胞简单高效地生成诱导神经元培养物。J. Vis. Exp. (2018)

该视频展示了如何从成人人类皮肤成纤维细胞（aHDFs）生成神经元。通过使用携带神经元转录因子基因和短发夹RNA（shRNAs）的慢病毒载体对aHDFs进行重编程。shRNAs可抑制神经元转录抑制因子的表达，而神经元转录因子则激活相关基因，促使aHDFs分化为神经元。这些重编程后的aHDFs在早期和晚期神经元转化培养基中进行培养，以生成成熟的神经元。

方案

1. 重编程用皮肤成纤维细胞的制备

1. 使用自动细胞解冻系统或37 °C水浴，解冻成人人类真皮成纤维细胞（aHDFs），并在T75培养瓶中每瓶接种200,000个细胞（使用自动细胞计数器计数），加入10 mL成纤维细胞培养基（见表1），于37 °C、5% CO₂条件下培养。
2. 次日更换全部成纤维细胞培养基。
3. 每3–4天更换一次成纤维细胞培养基，直至细胞达到95%融合度。
   注意：一个融合的培养瓶将含有约1,000,000个细胞。

2. 重编程铺板（第 −1 天）

注意：建议在短期实验（不超过30天）中使用明胶包被；而对于长期实验，则建议使用多聚-L-鸟氨酸、纤连蛋白和层粘连蛋白（PFL）包被。

1. 在接种aHDFs进行重编程前60分钟，用0.1%明胶（250 µL/孔）包被24孔板，并在37 °C下孵育。
2. 吸除aHDFs上的成纤维细胞培养基，用Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤一次。加入0.05%胰蛋白酶（每T75培养瓶1.5 mL），在37 °C下消化3–5分钟以解离细胞。
3. 加入成纤维细胞培养基以中和胰蛋白酶（每T75培养瓶冲洗3 mL），通过将培养瓶冲洗两次收集脱落的细胞至15 mL离心管中。
4. 在400 × g下离心5分钟，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL成纤维细胞培养基中。
5. 使用自动细胞计数仪对细胞进行计数（为确保良好的转化效率，应通过台盼蓝染色检测确认细胞活力高于90%）。
6. 对于完整的24孔板，将1,320,000个细胞重悬于13.2 mL成纤维细胞培养基中，配制成每毫升培养基含100,000个细胞的悬液（或根据所需孔数，按每孔550 µL培养基中接种55,000个细胞计算）。
7. 吸除孔板中的明胶溶液，用DPBS洗涤两次。每孔加入500 µL细胞悬液，于含5% CO₂的环境中37 °C过夜培养。

3. 病毒转导（第0天）

注意：操作慢病毒颗粒需要使用二级防护设备，并使用中和病毒的试剂。强烈建议佩戴两副手套。

1. 将13.2 mL成纤维细胞培养基预热至37 °C。
2. 在室温下解冻含有转录因子achaete-scute家族bHLH转录因子1（Ascl1）和Brn2以及两条靶向RE1沉默转录因子（REST）的短发夹RNA（shRNA）的慢病毒载体。
3. 向培养基中加入适量体积的慢病毒，以感染复数（MOI）为20的条件感染aHDFs，不使用任何转导增强剂。
   
4. 将24孔板中的培养基更换为含有慢病毒载体的成纤维细胞培养基（每孔500 µL），并在5% CO₂条件下于37 °C孵育过夜。
5. 次日，将各孔中的培养基更换为不含慢病毒载体的新鲜成纤维细胞培养基。
   注意：该培养基在7天内具有感染性，因此在病毒转导后的第一周内应采取适当的防护和操作措施。

4. 转化细胞的维持

注意： 转化开始后，细胞容易脱落；更换培养基时应小心将培养板倾斜，并使用 1,000 µL 移液器，避免细胞脱离。

1. 第3天，移除成纤维细胞培养基，并加入500 µL早期神经元转化培养基（见表1）。
2. 每周两到三次，从孔中取出225 µL旧培养基，并加入250 µL新鲜的早期神经元转化培养基。
3. 第18天，将每孔中的全部培养基移除，并替换为500 µL晚期神经元转化培养基（见表1）。
4. 此后每2–3天更换一次半量培养基，方法同上，使用晚期神经元转化培养基，持续至第25天或实验终点（图1A）。

表1. 所用不同培养基的成分。本方案中所需培养基的完整成分描述，包括成纤维细胞培养基、早期神经元转化培养基、晚期神经元转化培养基。

	储存浓度	工作浓度
成纤维细胞培养基
基础培养基	N/A	N/A
青霉素/链霉素	10,000 U/mL	100 mg/mL
FBS	N/A	10%
早期神经转化培养基 (ENM)
神经分化培养基	N/A	N/A
青霉素/链霉素	10,000 U/mL	100 mg/mL
CHIR99021	10 mM	2 µM
SB-431542	20 mM	10 µM
Noggin	100 µg/mL	0.5 µg/mL
LDN-1931189	10 mM	0.5 µM
VPA	1 M	1 mM
LM-22A4	20 mM	2 µM
GDNF	20 µg/mL	2 ng/mL
NT3	10 µg/mL	10 ng/µL
db-cAMP	50 mM	0.5 mM
晚期神经转化培养基 (LNM)
神经分化培养基	N/A	N/A
青霉素/链霉素	10,000 U/mL	100 mg/mL
LM-22A4	20 mM	2 µM
GDNF	20 µg/mL	2 ng/mL
NT3	10 µg/mL	10 ng/µL
db-cAMP	50 mM	0.5 mM

结果

图1：诱导神经元（iN）转化过程随时间的演变。（A）实验时间线及包装在慢病毒中用于重编程成人人类皮肤成纤维细胞的构建体图谱。每个黑色箭头代表一次培养基更换。（B）代表性相差显微图像，显示细胞在第0天至第22天转化过程中形态的变化（各图右上角标注时间）。图像使用10X物镜在相差显微镜下拍摄。（C）转导后第35天TAU与MAP2双免疫荧光染色图像。细胞用4%多聚甲醛固定，0.1% Triton DPBS溶液透化10分钟。用含5%血清的DPBS溶液封闭30分钟。一抗用封闭液稀释后，4 °C孵育过夜。荧光标记的二抗用封闭液稀释后室温孵育2小时...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞系
成人人类皮肤成纤维细胞			[C2 代次 #7] 供体为一名67岁女性。细胞取自英国剑桥约翰·范·吉斯特脑修复中心的帕金森病研究与亨廷顿病门诊。
成纤维细胞培养、转导与转化试剂
杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）[-CaCl2, -MgCl2]	Gibco	14190094
胰蛋白酶-EDTA [0.5%]	Gibco	15400-054	用DPBS稀释至0.05%。
Virkon（用于灭活病毒的试剂）	Viroderm	7511	用温水稀释成1%溶液。
Milli-Q水	Millipore
基础培养基 - 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）+ GlutaMax	Gibco	61965059
青霉素/链霉素 [10,000 U/mL]	Gibco	15140-122
胎牛血清（FBS）	Gibco	10270-106
CryoMACS® 二甲基亚砜（DMSO）10	Miltenyi	170-076-303
神经分化培养基 - NDiff 227	Takara-Clontech	Y40002
LM-22A4	Tocris	4607	将10 mg溶于1450 µL DMSO中。 储存浓度：20 mM。
胶质细胞系来源神经营养因子（GDNF）[重组人源]	R&D systems	212-GD-010	将10 µg溶于500 µL含0.1% BSA的DPBS中。储存浓度：20 µg/mL。
NT3 [重组人源]	R&D systems	267-N3-025	将25 µg溶于2.5 mL含0.1% BSA的DPBS中。储存浓度：10 µg/mL。
db-cAMP	Sigma Aldrich	D0627	将1 g溶于40.7 mL Milli-Q水中。 过滤后分装为500 µL或10 mL储存管。储存浓度：50 mM。
CHIR99021	Axon	1386	将2 µg溶于429.8 µL DMSO中。 储存浓度：10 mM。
LDN-193189	Axon	1509	将2 mg溶于360 µL DMSO中。 储存浓度：10 mM。
丙戊酸钠盐（VPA）	Merck Millipore	676380	将5 g溶于Milli-Q水中，配制成1 M储存液。注意：避免摄入、皮肤接触及吸入粉尘。
包被试剂
明胶	Sigma Aldrich	G2500	用Milli-Q水稀释至0.1%。
多聚-L-鸟氨酸	Sigma Aldrich	P3655	溶于Milli-Q水中。使用浓度为15 µg/mL。
纤连蛋白	ThermoFisher Scientific	33010-018	2 mL Milli-Q水 + 70 µL 0.25 M NaOH。使用浓度为5 µg/mL。
层粘连蛋白	ThermoFisher Scientific	23017-015	储存于-80°C。冰上解冻，保持低温并分装为30 µL。使用浓度为5 µg/mL。
设备
T75培养瓶 [Nunclon Delta表面]	ThermoFisher Scientific	156499
24孔板 [Nunc]	ThermoFisher Scientific	142485
1.5 mL聚丙烯管	Sigma Aldrich	Z336769
15 mL离心管	Sarstedt	6,25,54,502
50 mL离心管	Sarstedt	6,25,47,254
移液控制器			用于移取1–25 mL体积。
无菌移液管：5、10和25 mL	Sarstedt	86.1253.001, 86.1254.001, 86.1685.001
可调体积移液器：5、20、200和1,000 µL
无菌移液器吸头			用于移取0.5–1,000 µL体积。
ThawSTAR自动细胞解冻系统	BioCision	BCS-601
Countess II自动细胞计数仪	ThermoFisher Scientific	AMQAX1000
细胞计数板 [50片] 和台盼蓝 [0.4%]	ThermoFisher Scientific	C10228	与Countess II自动细胞计数仪配合使用。
层流罩
37 °C、5% CO2 湿化培养箱
离心机			适用于1.5、15和50 mL离心管。
轨道摇床
倒置荧光显微镜	Leica	DMI6000 B