利用人胶质母细胞瘤组织制备和维持脑片培养

摘要

来源：Parker, J. J.，等。用于研究肿瘤细胞迁移及抗侵袭药物对患者特异性作用的人源胶质母细胞瘤类器官切片培养模型。J. Vis. Exp. (2017)。

该视频展示了从胶质母细胞瘤组织中制备和维持类器官切片培养物的方法。将分离的组织包埋在琼脂糖基质中，使用振动切片机获取薄切片。随后将这些切片置于微孔板内的可渗透膜插件上，并在切片培养维持培养基中进行长期培养。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 切片前准备

1. 在计划进行肿瘤切除和组织采集的前一天，准备“组织处理”培养基和“切片培养维持”培养基（或使用两周内已配制的培养基）。向500 mL高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）中加入5 mL青霉素-链霉素溶液（10,000 U/mL）和5 mL 1 M 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES），配制成组织处理培养基。
2. 使用无酚红的神经元基础培养基（如 Neurobasal）配制250 mL切片培养维持培养基。在该培养基中添加10 mM HEPES、1× B-27 添加剂、400 µM L-谷氨酰胺、600 µM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、60 U/mL青霉素、60 µg/mL链霉素和6 U/mL制霉菌素。
3. 所有培养基均储存于4 °C，保存时间不得超过2周。

2. 手术当天：组织获取

1. 在获取组织的当天，使用高压灭菌的玻璃器皿和无菌技术，在超净工作台中配制 50 - 100 mL 的 1% 和 2%（质量/体积百分比）低熔点琼脂糖溶液于组织处理培养基中。需要准备两种浓度的琼脂糖，以应对肿瘤组织质地不可预测的变化。
2. 用微波炉加热琼脂糖悬浮液，直....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM 高糖培养基	Invitrogen (Gibco)	11960-044
Neurobasal-A 培养基（不含酚红）	Invitrogen (Gibco)	12349-015
B-27 补充剂（50倍浓度），无血清	Invitrogen (Gibco)	17504-044
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）	Invitrogen (Gibco)	15140-122
GlutaMAX 补充剂	Invitrogen (Gibco)	35050-061
L-谷氨酰胺（200 mM）	Invitrogen (Gibco)	25030-081
HEPES（1 M）	Invitrogen (Gibco)	15630-080
制霉菌素悬浮液	Sigma-Aldrich	N1638-20ML	在 DPBS 中浓度为 10,000 单位/mL，无菌处理，BioReagent，适用于细胞培养
UltraPure 低熔点琼脂糖	Invitrogen (Gibco)	16520-050	熔点为 65.5 °C，在 37 °C 下保持液态，并在低于 25 °C 时迅速凝固
Peel-A-Way 包埋模具（方形 - S22）	Polysciences, Inc.	18646A-1	用于肿瘤样本包埋的模具
不锈钢微型刮刀	Fisher Scientific	S50823	将仪器勺头颈部弯曲成 45 度角
弯曲型 Fisherbrand 精细解剖镊	Fisher Scientific	08-875
单刃剃刀片（American Safety Razors）	Fisher Scientific	17-989-001	刀刃厚度为 0.009"。装入切片机前需移除压接的钝边保护盖
Leica VT1000 S 振动切片机	Leica Biosystems	VT1000 S
亲水性 PTFE 细胞培养插件	EMD Millipore	PICM0RG50	直径 30 mm，亲水性 PTFE 材质，孔径 0.4 µm
35 mm 玻底培养皿	MatTek	P35G-1.5-20-C Sleeve	玻璃直径 20 mm，盖玻片玻璃厚度 1.5 mm
PECON 显微镜载物台培养箱	PeCON German	(已停产)	Incubator PM 2000 RBT 是一款可替代的产品，专为蔡司显微镜设计