利用人胶质母细胞瘤组织制备和维持脑片培养

摘要

来源：Parker, J. J.，等。用于研究肿瘤细胞迁移及抗侵袭药物对患者特异性作用的人源胶质母细胞瘤类器官切片培养模型。J. Vis. Exp. (2017)。

该视频展示了从胶质母细胞瘤组织中制备和维持类器官切片培养物的方法。将分离的组织包埋在琼脂糖基质中，使用振动切片机获取薄切片。随后将这些切片置于微孔板内的可渗透膜插件上，并在切片培养维持培养基中进行长期培养。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 切片前准备

1. 在计划进行肿瘤切除和组织采集的前一天，准备“组织处理”培养基和“切片培养维持”培养基（或使用两周内已配制的培养基）。向500 mL高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）中加入5 mL青霉素-链霉素溶液（10,000 U/mL）和5 mL 1 M 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES），配制成组织处理培养基。
2. 使用无酚红的神经元基础培养基（如 Neurobasal）配制250 mL切片培养维持培养基。在该培养基中添加10 mM HEPES、1× B-27 添加剂、400 µM L-谷氨酰胺、600 µM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、60 U/mL青霉素、60 µg/mL链霉素和6 U/mL制霉菌素。
3. 所有培养基均储存于4 °C，保存时间不得超过2周。

2. 手术当天：组织获取

1. 在获取组织的当天，使用高压灭菌的玻璃器皿和无菌技术，在超净工作台中配制 50 - 100 mL 的 1% 和 2%（质量/体积百分比）低熔点琼脂糖溶液于组织处理培养基中。需要准备两种浓度的琼脂糖，以应对肿瘤组织质地不可预测的变化。
2. 用微波炉加热琼脂糖悬浮液，直至出现轻微沸腾。随后将琼脂糖溶液置于 37 °C 水浴中，保持其液态直至使用。
3. 在 6 孔板的每个孔中加入 1 mL 的切片培养维持培养基。
4. 使用无菌镊子将空的聚四氟乙烯（PTFE）培养插件放入每个孔中。将该板置于加湿、水套式、含 5% CO₂ 的组织培养孵箱中，温度维持在 37 °C。
5. 在超净工作台中使用无菌巴斯德移液管，将 95% O₂/5% CO₂ 混合气体通入装有冰冻组织处理培养基的烧瓶中，持续约 15 至 30 分钟，于获取肿瘤组织前完成。使用超氧合培养基可最大限度减少组织处理过程中大块组织的缺氧状态。
6. 准备已标记的 50 mL 锥形管（数量足够用于分离所需数量的独立肿瘤区域），每管中加入 20 mL 超氧合的冰冻处理培养基，用于在手术室与切片制备场所之间转运组织。
7. 与神经外科医生协作，在术前规划用于取样的肿瘤区域。选择在患者临床影像上显示对比增强的肿瘤区域（T1 加钆磁共振成像（MRI）序列）。既往经验表明，该区域可获得具有活性的肿瘤组织，而非坏死组织。
   注意： 曾尝试从周围（瘤周）白质生成切片，但因背景自发荧光较强及肿瘤细胞密度降低，限制了这些切片的实验应用价值。
8. 在肿瘤切除手术初期获取肿瘤组织。避免采集经过广泛双极电凝处理的肿瘤组织，因其可能因热损伤而影响组织活性。与大块整段切除相比，分块切除过程中获取的组织样本表现出更高的活性。这一现象可能与手术切除导致的肿瘤组织血流剥夺程度不同以及获取时间延长有关。
9. 如需要，可将肿瘤组织分别标记并储存于不同的锥形管中，以分离来自不同肿瘤区域的样本（例如：表浅与深层肿瘤组织）。若术中可使用外科导航系统，则可精确记录各组织样本的位置信息。

3. 切片培养制备

1. 将肿瘤组织块置于含有冰浴处理液的培养皿中。为清洗肿瘤组织并尽量减少黏附的红细胞，使用移液器轻轻更换并弃去培养皿中的处理液，重复三次。
2. 使用手术刀将肿瘤组织块切割成矩形块状，修整组织至约 3 mm × 3 mm × 10 mm。通过切除或使用精细镊子施加轻柔牵引，小心去除任何附着的血管。
3. 将 5–7 mL 37 °C 的琼脂糖溶液加入一个小的立方体形（约 2 cm³）塑料包埋模具中。使用无菌温度计确认琼脂糖溶液温度不超过 37 °C 后方可使用。
4. 将琼脂糖置于冰床上静置约 1 分钟。
5. 将 2–4 个肿瘤组织“条带”垂直长轴方向放入琼脂糖中。注意：在琼脂糖凝固前，组织条带容易“下沉”。为避免此问题，需暂时固定组织条带于垂直位置，直至琼脂糖进一步凝固。
6. 将含有组织的琼脂糖模具置于冰床上 2–5 分钟，以促进完全凝固。
7. 从冰上取出模具，用手术刀沿模具边缘切割，轻轻取出琼脂糖块。避免对琼脂糖块施加过大压力，以防其破裂。
8. 使用适量氰基丙烯酸酯胶水将琼脂糖块固定于振动切片机的样品板上。让胶水固化约 1–2 分钟。
9. 向振动切片机储液槽中加入冰浴处理液，使固定在样品板上的琼脂糖块完全浸没。
10. 在切片过程中，通过修剪过的无菌塑料移液管向振动切片机储液槽中通入 95% O₂ / 5% CO₂ 气体混合物。
11. 将振动切片机的切片厚度设定为 300–350 µm。
12. 根据组织的一致性调整刀片推进速度和振幅。“较硬”的胶质母细胞瘤组织需要较慢的刀片推进速度和较高的振幅。具体刀片速度和振幅设置将因振动切片机型号不同而异。
    注意：切片过程中常出现若干问题。若组织条带从琼脂糖块上脱落，可尝试使用更高浓度的琼脂糖进行包埋。若切片厚度大于设定值（机器设定），或切片不对称，应提高振幅并降低 振动切片机刀片速度。为确保肿瘤组织未粘附于刀架或被其“拖拽”，在切片过程中，应使用微型刮铲在刀架与切片之间小心定位，随刀片移动进行调整。
13. 使用不锈钢微型刮铲将组织切片转移至含有冰浴处理液的培养皿中。
14. 从培养箱中取出含有聚四氟乙烯（PTFE）插件和已平衡的切片培养基的 6 孔板（按第 2 节第 4 步准备）。
15. 使用不锈钢微型刮铲将组织切片接种。尽量减少直接接触和操作组织，可使用小号细毛刷制造“液体波浪”，轻柔地将切片从刮铲上推至培养插件上。
    注意：尽量减少转移到组织培养插件上方的处理液量。若转移液体过多导致切片漂浮，应使用无菌巴斯德移液管吸除多余液体。
16. 将含有肿瘤切片的 6 孔板放回 37 °C、5% CO₂ 气氛的培养箱中。
    注意：整个包埋与切片操作流程应在手术室获取肿瘤组织后 90 分钟内完成。

4. 脑片培养的维持

1. 12 - 24 小时后，用无菌镊子夹住每个插件边缘，将脑片培养物转移至含有新鲜脑片培养维持培养基的培养板中。在转移插件前，确保分装至各孔中的脑片培养维持培养基在培养箱中平衡至少 15 分钟。
2. 每 48 小时将插件转移至新的 6 孔板中，加入新鲜且已平衡的脑片培养培养基。
3. 如需要，可用移液器吸取旧的脑片培养培养基，立即用于生化检测，或于 -80 °C 冻存以备后续使用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM 高糖培养基	Invitrogen (Gibco)	11960-044
Neurobasal-A 培养基（不含酚红）	Invitrogen (Gibco)	12349-015
B-27 补充剂（50倍浓度），无血清	Invitrogen (Gibco)	17504-044
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）	Invitrogen (Gibco)	15140-122
GlutaMAX 补充剂	Invitrogen (Gibco)	35050-061
L-谷氨酰胺（200 mM）	Invitrogen (Gibco)	25030-081
HEPES（1 M）	Invitrogen (Gibco)	15630-080
制霉菌素悬浮液	Sigma-Aldrich	N1638-20ML	在 DPBS 中浓度为 10,000 单位/mL，无菌处理，BioReagent，适用于细胞培养
UltraPure 低熔点琼脂糖	Invitrogen (Gibco)	16520-050	熔点为 65.5 °C，在 37 °C 下保持液态，并在低于 25 °C 时迅速凝固
Peel-A-Way 包埋模具（方形 - S22）	Polysciences, Inc.	18646A-1	用于肿瘤样本包埋的模具
不锈钢微型刮刀	Fisher Scientific	S50823	将仪器勺头颈部弯曲成 45 度角
弯曲型 Fisherbrand 精细解剖镊	Fisher Scientific	08-875
单刃剃刀片（American Safety Razors）	Fisher Scientific	17-989-001	刀刃厚度为 0.009"。装入切片机前需移除压接的钝边保护盖
Leica VT1000 S 振动切片机	Leica Biosystems	VT1000 S
亲水性 PTFE 细胞培养插件	EMD Millipore	PICM0RG50	直径 30 mm，亲水性 PTFE 材质，孔径 0.4 µm
35 mm 玻底培养皿	MatTek	P35G-1.5-20-C Sleeve	玻璃直径 20 mm，盖玻片玻璃厚度 1.5 mm
PECON 显微镜载物台培养箱	PeCON German	(已停产)	Incubator PM 2000 RBT 是一款可替代的产品，专为蔡司显微镜设计