建立人源血脑屏障的三重细胞共培养模型

摘要

来源：Fattakhov, N.，等。用于体外研究缺血性脑卒中的人源三重原代细胞共培养血脑屏障模型。J. Vis. Exp. (2022)

本视频展示了人脑周细胞、星形胶质细胞和内皮细胞的共培养。每种细胞层分别形成后共同培养，构建出模拟血脑屏障细胞排列的三层结构体系

方案

1. 三重细胞共培养血脑屏障模型的建立

1. 接种周细胞
   1. 在37 °C、5% CO₂培养箱中，使用具有促进细胞黏附活性表面的T75培养瓶培养HBVP（人脑血管周细胞），直至细胞融合。达到融合状态后，吸除旧的周细胞培养基，用5 mL温热的Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤细胞。吸除DPBS，使用4 mL温热的胰蛋白酶-EDTA溶液与1 mL DPBS组合消化，使细胞从培养瓶表面脱离。
      ​注意：避免使用超过P7代的细胞。
   2. 将培养瓶置于CO₂培养箱中37 °C孵育5分钟，显微镜下观察确认细胞是否已脱离。向瓶中加入5 mL温热的周细胞培养基（含2%胎牛血清[FBS]），将脱离的细胞转移至50 mL离心管中。
   3. 将细胞悬液在200 × g条件下离心3分钟，使细胞沉淀至管底。小心吸除上清液，确保细胞沉淀完整保留。
   4. 用周细胞培养基重悬细胞沉淀；根据细胞融合度及所需Transwell小室数量计算所需培养基体积。取10 µL重悬细胞悬液，加入细胞计数板，进行细胞计数。
   5. 确定细胞密度后，以每孔300,000个细胞、1 mL周细胞培养基的条件，将细胞接种至Transwell小室（6孔板格式）的基底侧（abluminal side）。
      注意：接种HBVP至小室底部时，需将6孔板倒置。将板平放于台面，取下底部部分以暴露小室的基底侧。在基底侧加入周细胞悬液后，用倒置的板盖住小室，防止蒸发。所有板均需倒置放置于37 °C、5% CO₂培养箱中过夜。
2. 接种星形胶质细胞
   1. 在37 °C、5% CO₂培养箱中，于T75培养瓶中培养HA（人星形胶质细胞），直至细胞融合。参照上述步骤1.1.1–1.1.4，使用星形胶质细胞培养基（同样含2% FBS）代替周细胞培养基。
      ​注意：避免使用超过P9代的细胞。
   2. 确定细胞密度后，以每孔300,000个细胞的密度将细胞接种至组织培养6孔板的底部。盖上盖子防止蒸发，并将所有板置于37 °C、5% CO₂培养箱中过夜。
3. 接种内皮细胞
   1. 在37 °C、5% CO₂培养箱中，于组织培养皿中培养HBMEC（人脑微血管内皮细胞），直至细胞融合。参照上述步骤1.1.1–1.1.4，使用完全经典培养基（含10% FBS）代替周细胞培养基。
      注意：避免使用超过P12代的细胞。
   2. 从37 °C、5% CO₂培养箱中取出含星形胶质细胞的组织培养6孔板以及含周细胞的Transwell小室（6孔板格式）。吸除6孔板中的星形胶质细胞培养基。向每孔中加入1 mL周细胞培养基和1 mL星形胶质细胞培养基。
   3. 吸除Transwell小室中的周细胞培养基，并将其转移至已接种星形胶质细胞的6孔板中。以每孔300,000个细胞的密度，将HBMEC接种于同一Transwell小室的顶侧（apical side），每孔加入2 mL完全经典培养基。
      注意：内皮细胞应在周细胞接种至小室基底侧及星形胶质细胞接种至6孔板后的次日进行接种。三重共培养体系应维持6天，以诱导血脑屏障样特性。实验前24小时应更换两个小室腔室中的培养基。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
24 mm 带 0.4 µm 孔径聚酯膜插件的 Transwell 小室	Corning	3450
35 mm 玻底培养皿	MatTek Life Sciences (FISHERSCI)	P35GC-1.5-14-C
星形胶质细胞培养基	Science Cell	1801
贴壁因子	Cell Systems (Fisher Scientific)	4Z0-201
含血清和 CultureBoost 的完全经典培养基	4Z0-500	Cell Systems
Corning 50 mL 聚丙烯离心管（锥形底，带 CentriStar 盖）	VWR	430829
Corning 75 cm² U 形斜颈未处理细胞培养瓶	Corning	431464U
Corning CellBIND 96 孔黑色聚苯乙烯微孔板（平底透明）	Corning	3340
Countes 细胞计数板载玻片	Thermo Fisher Scientific	C10228
Countess II FL 全自动细胞计数仪	Thermo Fisher Scientific	ZGEXSCCOUNTESS2FL
DMEM 培养基（无葡萄糖、无谷氨酰胺、无酚红）	ThermoFisher	A14430-01	无葡萄糖培养基
DPBS（无钙、无镁）	ThermoFisher	14190250
EBM 内皮细胞生长基础培养基（无酚红），500 mL	Lonza	CC-3129
CO2 培养箱
离心机