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1. 明胶甲基丙烯酰基（GelMA）的合成
- 称取10 g猪皮来源的明胶，加入100 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中，在加热板上以240 rpm转速、50 °C条件下搅拌至完全溶解。
- 在通风橱内，加入2 mL甲基丙烯酸酐（MA）以实现较低程度的功能化修饰，在240 rpm转速、50 °C条件下继续搅拌反应2小时。
注意： MA危险性说明：H302 + H332（吞咽或吸入有害），H311（皮肤接触有毒），H314（造成严重皮肤灼伤和眼损伤），H315（引起皮肤刺激），H317（可能引起过敏性皮肤反应），H318（造成严重眼损伤），H331（吸入有毒），H332（吸入有害），H335（可能引起呼吸道刺激）。操作指南：P261（避免吸入粉尘/烟/气体/烟雾/蒸气/喷雾），P305 + P351 + P338 + P310（如进入眼睛：用清水小心冲洗数分钟。如戴有隐形眼镜且易于取出，应将其取出。持续冲洗。立即呼叫中毒中心或就医），P301 + P312 + P330（如误吞：如有不适，立即呼叫中毒中心或就医。漱口）。
注意： 应极其缓慢地逐滴加入MA。
- 将明胶-MA溶液加入100 mL预热至50 °C的PBS中进行稀释，最终体积为200 mL，并在240 rpm转速、50 °C条件下继续搅拌10分钟。
- 剪取约20 cm长的透析膜（截留分子量12–14 kDa），浸泡于去离子水中直至变软。
注意：用去离子水充满透析膜，以确保无孔洞或缺陷。
- 使用漏斗将明胶-MA溶液转移至透析膜中。
注意：封闭两端时应预留足够内部空间以容纳溶液膨胀。
- 将装有明胶-MA溶液的透析膜置于盛有2 L蒸馏水的容器中进行透析，在40 °C、500 rpm条件下持续搅拌5天。
注意： 应覆盖容器以防止水分蒸发。
- 每天更换蒸馏水两次，每次更换时将透析膜翻转倒置以促进均匀透析。
- 第五天时，将200 mL预热的超纯水（40 °C）与透析后的明胶-MA溶液混合，并在40 °C条件下搅拌15分钟。
- 将明胶-MA溶液分装至50 mL锥形管中，每管不超过25 mL，于-80 °C条件下静置2天。
注意：将离心管水平放置，以利于后续冻干。
- 将冷冻样品冻干3–5天，并将所得冻干GelMA置于防潮条件下保存。
2. 生物墨水制备
注意：为了获得 1 mL 的生物墨水，建议至少制备 3 mL 的生物材料溶液，因为在过滤过程中可能会有损失。
- 纤维蛋白原溶液的制备
- 使用去离子水配制0.9%的氯化钠溶液，并将10 mg牛血浆来源的纤维蛋白原溶解于1 mL该生理盐水中，得到浓度为10 mg/mL的溶液。
注意：由于纤维蛋白原易吸附于玻璃表面，因此不得使用玻璃容器配制纤维蛋白原溶液。
- 将溶液在37 °C条件下持续振荡，直至纤维蛋白原完全溶解。
注意：溶解纤维蛋白原时，可使用置于37 °C培养箱内的旋转装置。也可在37 °C加热板上以磁力搅拌（180 rpm）方式进行。在此条件下，10 mg/mL的纤维蛋白原约需40分钟完全溶解。
- 明胶/GelMA溶液的制备
- 称取0.12 g明胶，加入1.9 mL预热至40 °C的PBS缓冲液中，配制成终浓度为4%（w/v）的明胶溶液。涡旋振荡以促进溶解。
- 将混合液保持在40 °C，直至明胶完全溶解。
- 称取0.06 g冻干GelMA粉末，转移至上述明胶溶液中，得到终浓度为2%（w/v）的GelMA溶液。涡旋振荡以促进溶解。
- 将溶液保持在40 °C，直至GelMA完全溶解。
3. 星形胶质细胞负载明胶/GelMA/纤维蛋白原生物墨水的制备
- 移取0.9 mL的10 mg/mL纤维蛋白原溶液，加入明胶/GelMA溶液中，使纤维蛋白原的终浓度为3 mg/mL。
- 称取0.015 g光引发剂（PI），转移至明胶/GelMA/纤维蛋白原溶液中，使PI终浓度为0.5%（w/v）。通过上下翻转试管混合溶液，并在40 °C避光保存，以防止PI降解。
注意： 将生物墨水在 4 °C 下储存，最长不超过 24 小时。
- 在层流条件下，使用 0.2 µm 滤器将溶液过滤至无菌的 15 mL 离心管中。
注意： 生物材料溶液的温度应保持在37–40 °C，以利于过滤。
- 将980 µL的生物材料溶液转移至15 mL锥形管中。
- 用生理盐水稀释层粘连蛋白，配制浓度为100 µg/mL的储备液。
- 移取20 µL层粘连蛋白，加入含有生物墨水的离心管中，使层粘连蛋白终浓度为2 µg/mL。
- 轻轻吹打混匀，避免产生气泡。若仍有气泡残留，将锥形管在200 x g条件下离心 g 2 分钟。将生物墨水置于 37 °C 环境中保存，直至与细胞混合。
- 用0.05%胰蛋白酶消化原代星形胶质细胞5分钟。
注意： 使用第1至第3代的星形胶质细胞。
- 用 FBS 按 1:1 比例中和胰蛋白酶活性，将细胞转移至 15 mL 圆底离心管中。在 200 x g 5 分钟。
- 计数细胞，并将1 × 10⁶个细胞转移至另一离心管中。以200 × g离心 g 5 分钟。
- 轻轻敲击锥形管底部，去除上清液，留下少量液体（约200 µL）以重悬细胞沉淀。
- 将1 mL明胶/GelMA/纤维蛋白原溶液转移至含有细胞的离心管中，轻轻吹打混匀，获得终浓度为1 × 10⁶ 个细胞/mL的均匀混合液。6 细胞/毫升
3. 交联剂溶液的制备
- 凝血酶的重悬
- 在15 mL圆底管中，用无菌去离子水配制含0.1% (w/v) 牛血清白蛋白（BSA）的100 U/mL凝血酶储存液。分装后于-20 °C保存。
注意：由于凝血酶可吸附于玻璃表面，切勿使用玻璃容器配制储存液或保存分装样品。
- 凝血酶-CaCl2 溶液的配制
- 取100 µL凝血酶储存液，加入含有8.9 mL无菌去离子水的50 mL圆底管中，使凝血酶终浓度为1 U/mL。
- 用去离子水配制10% (w/v) CaCl2 溶液，并使用0.2 µm滤器除菌。
- 将1.1 mL 10% CaCl2 溶液加入含凝血酶的圆底管中，使CaCl2与凝血酶的终体积比为1:9。
注意：交联剂溶液应根据实验所需体积现配现用，避免储存。
4. 使用挤出式生物打印机打印含星形胶质细胞的生物墨水
- 神经组织的设计
- 使用 G 代码：在 X 和 Y 轴上构建一个 6 × 6 mm（方形）的网格，每条生物打印线之间间距为 1 mm，在 Z 轴上设置 6 层（每条线之间间隔 0.2 mm）；设定挤出量（E）为 0.01 mm，并在 Z 轴每一新层增加 0.001 mm；设定打印速度（F）为 400 mm/min（补充信息）。
- 生物打印机的设置
- 用紫外光照射设备 15 分钟，然后用 70% 乙醇擦拭。
- 使用电源开关打开生物打印机。通过 USB 线将设备连接至计算机。打开控制软件，连接至生物打印机并加载设计文件。
- 生物打印注射器的准备
- 使用 1,000 µL 移液器将含星形胶质细胞的明胶/GelMA/纤维蛋白原生物墨水转移至 5 mL 塑料注射器中。
注意：缓慢转移以避免产生气泡。
- 将一根无菌 22 G 钝头针头连接到注射器上。
注意：将注射器置于 4 °C 环境中静置 2 分钟。
- 将注射器连接至生物打印机的打印头，并手动挤出生物墨水以去除残留气泡。
- 生物打印
注意：生物打印在超净工作台外进行。
- 将一个 35 mm 培养皿放置在生物打印机平台上，并将针头定位在距离培养皿表面 0.1 mm 的位置，以允许针头移动。
注意：每次生物打印使用一个 35 mm 培养皿。
- 按下 打印 按钮。
- 生物打印完成后，确保注射器移离培养皿。然后盖上培养皿，准备进行交联处理。
注意：单个结构的生物打印过程约需 1 分 10 秒。
- 生物打印结构的交联与培养
- 将培养皿置于 2 mW/cm² 的紫外光下，上下各照射 60 秒，共 2 次，以实现 GelMA 的交联。
- 在超净台内，使用无菌刮铲将生物打印结构转移至 24 孔板中。
- 加入 500 µL 凝血酶/CaCl2 溶液，静置 30 分钟以完成纤维蛋白交联。
- 移除交联溶液，用 2 mL 1× PBS 洗涤结构一次，随后更换为 1 mL 星形胶质细胞培养基，置于 37 °C、5% CO2 条件下培养。每隔 3 天更换一次培养基。