来源：Xiao, W., 等. 基于透明质酸的水凝胶用于胶质母细胞瘤患者来源细胞的三维培养。J. Vis. Exp. (2018)。
本视频展示了如何将来源于脑肿瘤的胶质瘤球分离为单个细胞，并将其包封在基于透明质酸的水凝胶中。该过程促进细胞间的相互作用，形成结构化的三维胶质母细胞瘤模型。
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方法文章
一种基于透明质酸的水凝胶用于胶质母细胞瘤细胞的三维培养
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。
1. 透明质酸的硫醇化
注意：摩尔比是相对于羧酸根基团的总数而言的，除非另有说明。
- 在已高压灭菌的 250 mL 锥形瓶中，将 500 mg 透明质酸钠（HA，500–750 kDa）以 10 mg/mL 的浓度溶于去离子蒸馏水（DiH2O）中。在室温下搅拌溶液（约 200 rpm）2 小时，使 HA 完全溶解。在巯基化过程中，使用搅拌子和磁力搅拌器持续搅拌反应液。
- 使用 0.1 M 盐酸（HCl）将 HA 溶液的 pH 调至 5.5。称取 69.6 mg（0.25 倍摩尔比）1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺（EDC）。
注意：尽管未溶解的 EDC 可直接加入 HA 溶液中，但通常更便于先将其溶于 1 mL DiH2O 中，然后迅速将 EDC 溶液加入 HA 溶液。在步骤 1.3 和 1.4 中加入反应前，N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和胱胺二盐酸盐也可预先溶于 1 mL DiH2O 中。 - 向反应体系中加入 17.9 mg（0.125 倍摩尔比）NHS。使用 0.1 M HCl 将反应液 pH 调至 5.5，并在室温下孵育 45 分钟。
- 向反应液中加入 70.0 mg（0.25 倍摩尔比）胱胺二盐酸盐。使用 0.1 M 氢氧化钠（NaOH）将 pH 调至 6.25。在室温下持续搅拌，过夜孵育反应液。
- 次日，使用 1 M NaOH 将反应液 pH 调至约 8。向反应体系中加入 192 mg（4 倍摩尔比）二硫苏糖醇（DTT）。加入 DTT 后再次将 pH 调至 8，并在室温下继续搅拌 1–2 小时。
- 使用 1 M HCl 将 pH 调至 4。将整个反应混合物转移至预先浸泡的透析膜（截留分子量约 13 kDa）中，并在 pH 4 预调节的 DiH2O 中进行透析。
注意：透析所用 DiH2O 的体积应至少为反应后 HA 溶液体积的 40 倍（例如，50 mL 样品使用 2 L DiH2O，pH 4）。 - 在室温下，每天更换透析液（DiH2O，pH 4）两次，持续 3 天。
- 使用 0.22 µm 膜、真空驱动滤器过滤透析后的溶液。将巯基化 HA 溶液在液氮中快速冷冻。使用冷冻干燥机冻干样品，持续 2 天。干燥状态的巯基化 HA 可在 -20 °C 的真空密封干燥器中保存至少 6 个月。
- 为测定巯基化程度，可采用 Ellman 法检测和/或质子核磁共振（NMR）波谱分析。
2. 交联材料的制备
- 将巯基化透明质酸（thiolated HA）以所需浓度（本示例中为13.3 mg/mL）溶解于HEPES缓冲盐水（含20 mM HEPES的Hank's平衡盐溶液（HBSS）缓冲液，调节pH至8–9范围内）的棕色瓶中，以尽量减少暴露于环境光。保持溶液持续搅拌。
注意：若pH高于8、溶液浓度过高，或在凝胶化前长时间持续搅拌，可能导致连接在透明质酸上的巯基之间形成二硫键。为避免此问题，建议使用低于15 mg/mL的巯基化透明质酸，并在制备水凝胶前2小时内完成溶解。 - 将四臂聚乙二醇马来酰亚胺（4-arm-PEG-maleimide，PEG-Mal，20 kDa）和四臂聚乙二醇巯基（4-arm-PEG-thiol，PEG-thiol，20 kDa）溶解于磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）中，配制50 mg/mL的PEG-Mal和PEG-thiol储备溶液。
注意：完全溶解PEG试剂至少需要1小时。 - 若需添加来源于细胞外基质（ECM）的肽段，请将含半胱氨酸的肽段溶解于PBS中，配制储备溶液。
注意：储备液浓度建议为2–4 mM。 - 将硅橡胶模具在乙醇中浸泡至少20分钟以清洁，随后进行高压灭菌以实现消毒。
3. 水凝胶交联与细胞包封
注意： 以封装四个独立的、体积为80 µL、含0.5%（w/v）HA且压缩模量为1 kPa的水凝胶为例进行说明3。请参见 表1例如，制备具有不同特性的水凝胶的配方：两种水凝胶含有整合素结合肽 RGD，另两种水凝胶含有半胱氨酸封端基团作为肽活性的阴性对照。患者来源的胶质母细胞瘤（GBM）细胞接种浓度为 500,000 个细胞/mL。
- 将PEG-Mal储备液（50 mg/mL，来自步骤2.2）用PBS稀释至12.5 mg/mL，即取40 µL储备液加入120 µL PBS中。将稀释后的溶液分装至两个1.5 mL离心管中，每管80 µL。
- 向其中一管加入16 µL RGD储备液（2.8 mM，来自步骤2.3），向另一管加入16 µL半胱氨酸储备液（2.8 mM，来自步骤2.3）。涡旋混匀。将PEG-Mal-RGD或PEG-Mal-CYS溶液置于冰上，待步骤3.9使用。
注意：本方案所描述的条件可获得含肽浓度约140 µM的水凝胶。这相当于每8个可反应的PEG支臂中约有1个被肽占据。通过调整末端为半胱氨酸的肽与马来酰亚胺基团的摩尔比，可调节该比例。通常，肽的最大浓度可达280 µM，同时仍保留足够数量的马来酰亚胺基团用于水凝胶交联。 - 将PEG-硫醇储备液（50 mg/mL，来自步骤2.2）用PBS稀释至5 mg/mL，方法为将4 µL 50 mg/mL储备液与36 µL PBS混合。向该混合液中加入120 µL步骤2.1中溶解的硫醇化透明质酸（HA）。
注意：高分子量HA（HMW HA）溶液黏度很高。因此，建议使用宽口移液枪头转移溶液。移液时应缓慢操作，避免溶液黏附在枪头内壁，以提高测量准确性。 - 将洁净干燥的模具（步骤2.4中制备）放入未经组织培养处理的12孔板的每个孔中。使用洁净的移液枪头钝端轻压模具，检查模具与孔板底部之间的密封性。
注意：在包封前再次检查密封情况，以防泄漏。 - 传代培养的GBM细胞，将其解离为单细胞并按前述方法测定细胞浓度3。
注意：某些GBM细胞系无法完全解离为单细胞。在此情况下，可直接包封整个胶质瘤球。但为提高实验重复性，建议在精确计数后使用解离的单细胞。不同实验室的胶质瘤球传代方法各异，其中许多方法均可与水凝胶包封兼容。- （推荐）将胶质瘤球在500 × g下离心5分钟。弃去上清液，向细胞沉淀中加入1 mL细胞解离酶，轻轻振荡混匀，于室温孵育5分钟。
- 向细胞中加入4 mL完全培养基（含50 ng/mL EGF、20 ng/mL FGF-2、25 µg/mL肝素、G21补充剂及1%青霉素/链霉素的DMEM/F12培养基）。
- 再次在500 × g下离心5分钟，弃去上清液。最后将细胞沉淀重悬于1 mL完全培养基中，并通过70 µm细胞筛过滤。为最大程度回收细胞，建议用额外4 mL完全培养基冲洗滤筛。
- 使用血细胞计数板估算细胞悬液的浓度。将细胞悬液分装至两个离心管中，每管约含80,000个细胞。在500 × g下离心5分钟；通常，80,000个细胞可制备两个80 µL的水凝胶。
- 弃去上清液，将一份细胞沉淀重悬于80 µL PEG-MAL-RGD溶液中，另一份重悬于80 µL PEG-MAL-CYS溶液中（步骤3.1中制备）。
- 使用200 µL宽口移液枪头，将40 µL HA溶液（来自上述步骤3.3）加入每个橡胶硅胶模具中（步骤3.4中制备）。
- 使用200 µL宽口移液枪头，将40 µL PEG-MAL-CYS或PEG-MAL-RGD细胞悬液与模具中的HA溶液混合。快速吹打混匀，不超过10次。对每个待制备的凝胶重复此操作。
注意：此步骤需要练习，因为初始凝胶化反应迅速（30秒内）。吹打时应移动枪头在模具内不同位置操作，以确保混合均匀。始终保持枪头位于液面以下，避免产生气泡。吹打次数不宜过多，以防凝胶在枪头内形成。可通过调整PEG-MAL-CYS与PEG-MAL-RGD的比例，获得所需的RGD肽浓度。 - 将含有包封细胞的孔板放入37 °C细胞培养箱中孵育5–10分钟，以确保反应完全。
- 向每个含有凝胶的孔中加入2–2.5 mL培养基。使用无菌的2 µL移液枪头或微型刮刀，轻轻分离模具与凝胶。用预灭菌镊子将模具从孔板中取出。将孔板放回细胞培养箱（37 °C，5% CO2）中继续培养并用于后续实验。
注意：应垂直向上提起模具，避免损伤凝胶培养物。通常，凝胶培养体系中的培养基应每3–4天更换一次。更换培养基时注意不要吸走水凝胶。若存在此问题，建议使用塑料移液管。若计划通过生物发光成像监测细胞数量，则需在包封前将GBM细胞用编码组成型表达荧光素酶的慢病毒转导，方法如前所述3。进行生物发光成像前1小时，向培养基中加入1 mM D-荧光素。
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结果
表1. 可独立调控透明质酸浓度与机械性能的水凝胶配方。
| 凝胶类型 | 组分 A（各 40 µL） | 组分 B（各 40 µL） | ||||
| 4Arm-PEG-MAL（50mg/mL） | 半胱氨酸或 RGD（2.81mM） | PBS（pH 7.4） | 4Arm-PEG-硫醇（50mg/mL） | |||
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| pH计 | Thermo Fisher | N/A | 任何具有pH 2-10检测灵敏度的pH计 |
| 磁力搅拌器 | Thermo Fisher | N/A | 常规实验室设备 |
| 锥形瓶（125 mL） | Thermo Fisher | FB-501-125 | |
| 2 L聚丙烯烧杯 | Thermo Fisher | S01916 | |
| 透明质酸钠 | Lifecore | HA700k-5 | 分子量范围为500–750 kDa |
| 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC） | Thermo Fisher | PI-22980 | |
| N-羟基琥珀酰亚胺（NHS） | Sigma Aldrich | 130672-5G | |
| 盐酸（HCl） | Thermo Fisher | SA48-500 | |
| 氢氧化钠（NaOH） | Thermo Fisher | SS266-1 | |
| 胱胺二盐酸盐 | Thermo Fisher | AC111770250 | |
| 二硫苏糖醇（DTT） | Thermo Fisher | BP172-25 | |
| Ellman试剂（5-(3-羧基-4-硝基苯基)二硫代-2-硝基苯甲酸） | Sigma Aldrich | D218200-1G | |
| 重水（氧化氘） | Thermo Fisher | AC166301000 | |
| 0.22 µm 真空驱动滤器 | CellTreat | 229706 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Thermo Fisher | P32080-100T | |
| Hanks'平衡盐溶液（HBSS） | Thermo Fisher | MT-21-022-CV | |
| 4臂-PEG-马来酰亚胺 | JenKem Technology | A7029-1 | 分子量约为20 kDa |
| 4臂-PEG-巯基 | JenKem Technology | A7039-1 | 分子量约为20 kDa |
| L-半胱氨酸 | Sigma Aldrich | C7880-100G | |
| RGD细胞外基质模拟肽 | Genscript Biotech | N/A | 定制肽，序列为"GCGYGRGDSPG"，N端需乙酰化 |
| 硅胶模具 | Sigma Aldrich | GBL664201-25EA | 使用剃刀片切割成单个部件 |
| 完全培养基 | 多种来源 | 多种 | DMEM/F12（Thermo Fisher）添加无血清补充剂（GeminiBio的G21）、表皮生长因子50 ng/mL（Peprotech）、成纤维细胞生长因子20 ng/mL（Pepro Tech）和肝素25 µg/mL（Sigma Aldrich）；不同实验室的培养基配方可能有所不同 |
| 患者来源的胶质母细胞瘤细胞 | N/A | N/A | |
| 蛋白酶/磷酸酶抑制剂小片剂 | Sigma Aldrich | 5892970001 | |
| TrypLE Express | Thermo Fisher | 12604013 | |
| 70 µm 细胞筛 | Thermo Fisher | 22-363-548 | |
| 细胞培养孵箱 | Thermo Fisher | N/A | 任何具备5% CO₂和37°C条件的通用孵箱 |
| 冰箱/冷冻柜 | Thermo Fisher | N/A | 任何具备-20°C和-80°C储存能力的常规实验室设备 |
| 一次性包埋模具 | Thermo Fisher | 12-20 | |
| 宽口移液器吸头 | Thermo Fisher | 9405120 |
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