分析器官型小脑切片培养中浦肯野细胞的存活情况

摘要

来源：Rakotomamonjy, J., 等. 体外脑片培养中浦肯野细胞的存活. J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了一种从小鼠幼崽脑组织中获取小脑器官型切片的技术，并将切片培养于添加了营养物质和生长因子的培养基中，以模拟小脑的发育过程 体外 此外，将特定的小脑切片用测试化合物处理，并采用免疫荧光染色技术分析该化合物的神经保护能力。

方案

1. 小脑组织切片培养前的准备

1. 在事先用70%乙醇喷洒过的细胞培养超净台内，准备250 mL瓶口式真空过滤器并连接无菌接收瓶，配制200 mL培养基。加入100 mL基础培养基Eagle（BME）、50 mL Hank's平衡盐溶液（HBSS）、50 mL热灭活马血清、1 mL 200 mM L-谷氨酰胺（终浓度1 mM）以及5 mL 200 g/L葡萄糖溶液（终浓度5 mg/mL）。通过真空过滤灭菌培养基，并置于+4 °C保存，可保存长达一个月。
2. 在无菌生物安全柜中，从包装中取出一个6孔细胞培养板，每孔加入1 mL培养基。若进行处理实验，向处理孔中加入药理学试剂，对照孔中则加入等体积的溶剂对照溶液。在本研究中，向处理孔加入1 μL无菌3 M KCl溶液（终浓度30 mM），向对照孔加入1 μL无菌水。
3. 将所需数量的独立包装、带有亲水性聚四氟乙烯（PTFE）膜（孔径 = 0.4 μm）的细胞培养小室移入细胞培养超净台内。小心拆开包装，用无菌镊子取出细胞培养小室，逐个放入6孔板的孔中，避免小室膜与培养基界面之间产生气泡。将小室置于37 °C、5% CO₂培养箱中，在接种细胞前至少平衡2小时。
   注意：组织切片机长期存放于细胞培养超净台内。
4. 准备两个200 mL烧杯，一个装入150 mL无菌水，另一个装入150 mL 70%乙醇。使用前将手术器械依次浸入70%乙醇和无菌水中进行消毒。
   注意：手术器械接触乙醇后不可立即使用。
5. 将双刃刀片在70%乙醇烧杯中消毒，用无菌镊子将其安装至刀片架上，并使用刀片夹紧扳手固定。晾干后待用。
6. 将组织切片机配套的塑料圆盘在70%乙醇烧杯中消毒。放置圆盘前，用70%乙醇喷洒切割台表面，晾干后待用。

2. 解剖与小脑器官型切片培养

1. 将小鼠幼崽带入细胞培养超净台内进行解剖操作。
2. 使用直型手术剪迅速剪下幼崽头部 (图1A)。
3. 用直型敷料镊夹住幼崽鼻部固定头部，从后端开始，沿中线两侧方向用直型眼科剪剪开头皮。
4. 颅骨的切开步骤同上。
   注意：操作时务必使剪刀尖端朝外，避免解剖过程中损伤小脑。
5. 取出脑组织并转移至盛有冷的HBSS + 5 mg/mL葡萄糖溶液的60 mm培养皿中。
6. 使用无菌直型精细镊小心分离出小脑 (图1B)，再用无菌弯型精细镊将其转移至组织切片机切割台上的塑料载片上。
7. 通过旋转切割台调整组织方向，以便进行旁矢状切面切片。
8. 向右拉动切割台释放旋钮，移动切割台，使刀片位于组织边缘。
9. 将切片厚度调整为350 µm，刀片速度设为中等。
10. 启动切片机。待整个小脑完全切片后 (图1C)，关闭切片机。
11. 用无菌镊子取出塑料载片。
12. 小心将塑料载片移至盛有HBSS + 5 mg/mL葡萄糖溶液的60 mm培养皿附近，使用无菌移液管将冷的HBSS + 5 mg/mL葡萄糖溶液滴加到组织上，使小脑切片落入缓冲液培养皿中以便收集。
13. 使用微探针将小脑切片彼此分离，用移液管吸取质量良好的切片（建议选择靠近蚓部的组织切片），并将其放入预先平衡的细胞培养插入式培养皿中 (图1D)。
14. 用微探针将小脑切片在细胞培养插入式培养皿上定位，然后用移液管小心吸除多余的HBSS + 5 mg/mL葡萄糖溶液。
    注意：此阶段组织极为脆弱，易受物理损伤。每张细胞培养插入式培养皿所能承载的小脑切片数量取决于供体动物的年龄：P0–P4龄动物可培养6–8片，P5以上龄动物则为4–6片。
15. 将培养皿放入培养箱中，每2–3天完全更换一次培养基。
16. 为评估浦肯野细胞存活情况，可在体外培养5天时即开始收集切片。若用于其他目的，切片可在培养体系中维持数周 (图1F)。
    注意：在进行浦肯野细胞存活实验时，更换培养基时无需重新添加药理学处理剂 (图1F)。

3. 免疫荧光

1. 从培养箱中取出6孔板。吸除细胞培养基，用1× PBS洗涤细胞培养插件，并在插件下方加入1 mL、上方加入500 µL冷的4%多聚甲醛溶液，于4℃固定1小时。
2. 在旋转摇床上用1× PBS对插件进行4次洗涤，每次10分钟，每次在插件下方加入1 mL、上方加入500 µL。
3. 用刷子将小脑切片从一个细胞培养插件转移至已预装含有1× PBS、0.25% Triton X-100和3% BSA（PBS-TB）的24孔板中的一个孔内，每孔500 µL。
4. 在室温下用PBS-TB溶液孵育切片1小时，以进行通透和封闭处理。
5. 将一抗用PBS-TB溶液稀释后加入，每孔200 µL，在4℃下避光孵育过夜，同时置于旋转摇床上。
6. 次日，在旋转摇床上用1× PBS进行4次洗涤，每次10分钟，每孔500 µL。
7. 加入用PBS-TB溶液稀释的二抗，每孔200 µL，在室温下避光孵育2小时，并置于旋转摇床上。
8. 在旋转摇床上用1× PBS进行4次洗涤，每次10分钟，每孔500 µL。
9. 使用Hoechst 33342（用1× PBS稀释至2 µg/mL）对切片进行核复染，在室温下避光孵育10分钟，每孔500 µL。
10. 用移液管将小脑切片转移至显微镜载玻片上，避光完全自然干燥。随后用1× PBS重新润湿切片，并在盖玻片上滴加少量封片剂（约80 µL），然后覆盖于切片上。操作过程中应避免产生气泡。
11. 待封片剂完全固化后，小脑切片即可用于成像。

4. 细胞存活的成像与定量分析

1. 根据制造商说明打开显微镜和激光器。
2. 启动图像采集软件。
3. 使用10倍物镜，定位未发生改变的小脑切片，这些切片通常包含9–10个叶（一般为靠近小脑蚓部的小脑切片）。
4. 启动z轴层扫采集功能。设定z轴层扫范围，以涵盖小脑切片中所有存在的浦肯野细胞。设置步长为2 µm，并开始采集。将采集的图像以采集软件制造商指定的格式保存，以保留相关元数据。
5. 使用Bio-formats插件在ImageJ中打开采集的文件。
6. 进入图像 > 层叠 > z轴投影… （图2A）。
7. 在“投影类型”下拉菜单中选择“最大强度投影”（Max Intensity），然后点击确定 （图2B）。
8. 将生成一幅二维平面图像。双击多点工具，使“点工具”窗口出现。取消勾选“标记点”选项，以便更清晰地观察已计数的细胞。随后直接点击浦肯野细胞的胞体开始计数 （图1E）。已计数细胞的总数将显示在“点工具”窗口底部 （图3）。
   注意：通常，每个细胞培养插件中至少可量化3个无损伤且包含9–10个叶的切片。为评估药理学试剂的神经保护作用，应至少进行3次独立实验。

结果

图 1：从小鼠解剖到浦肯野细胞存活率定量的实验流程示意图。 幼鼠迅速断头处死 (A)。取出脑组织后，分离小脑 (B)，并将其切成 350 µm 宽的切片 (C)。将小脑切片置于对照组或处理组的细胞培养插入式培养板上 (D)，并在体外培养至少 5 天。随后用 4% 多聚甲醛固定组织，进行免疫染色，并使用共聚焦显微镜采集图像。最后，利用 ImageJ 软件中的多点工具对每一片切片中的浦肯野细胞数量进行定量 (E)。(F) 体外培养期间 KCl 处理的时间...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Alexa Fluor 594 驴抗小鼠 IgG 二抗	ThermoFisher scientific	A21203
基础培养基 Eagle (BME)	ThermoFisher scientific	21010046
II 级 A2 型生物安全柜	NuAire	NU-540-400
牛血清白蛋白	Millipore Sigma	A2153
刷子
抗钙结合蛋白 D-28K 抗体 (CB-955)	Abcam	ab82812
CO2 培养箱	NuAire	NU-5700
Corning Costar 平底 6 孔细胞培养板	Fisher Scientific	07-200-83
盖玻片，22 × 50 mm	Fisher Scientific	12-545-E
直头持针镊	Harvard Apparatus	72-8949
双刃刀片	Fisher Scientific	50949411
200 证乙醇	Decon Labs, Inc	2701
直头眼科剪	Harvard Apparatus	72-8428
精细镊子	Fisher Scientific	16-100-127
L-谷氨酰胺 100X	ThermoFisher scientific	25030149
葡萄糖溶液	ThermoFisher scientific	A2494001
Hanks' 平衡盐溶液	ThermoFisher scientific	14025092
Hoechst 33342，三盐酸盐，三水合物	Fisher Scientific	H21492
马血清，热灭活，新西兰来源	ThermoFisher scientific	26050088
ImageJ
McIlwain 组织切片机	Fisher Scientific	NC9914528
微型探针	Fisher Scientific	08-850
Millicell 细胞培养小室	Millipore Sigma	PICM0RG50
Nalgene 快速流动一次性无菌滤器（PES 膜，250 mL）	ThermoFisher scientific	168-0045
Nikon A1R 共聚焦激光显微镜系统	Nikon
NIS-Elements 成像软件	Nikon
多聚甲醛	Acros Organics	41678-0010
巴斯德吸管	Fisher Scientific	13-678-20D
氯化钾	Fisher Scientific	BP366-500
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂	ThermoFisher scientific	P10144
直头手术剪	Harvard Apparatus	72-8403
轨道摇床 Belly Dancer	IBI Scientific	BDRLS0003
Prism 8	GraphPad
Superfrost Plus 显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-550-15
组织培养皿，60 mm 带握环	Fisher Scientific	FB012921
24 孔组织培养板	Falcon/Corning	353047
无菌移液管	ThermoFisher scientific	13-711-21
Triton X-100	ThermoFisher scientific	BP151-500