来源：Servello, D. 等，用于研究中枢神经元轴突曲张体形成与恢复的微生物力学系统。J. Vis. Exp. (2018)。
本视频演示了使用酶解法和机械解离法从海马组织样本中分离和培养海马神经元。使用阿糖胞苷（Ara-C）处理可抑制非神经元细胞的生长，从而促进海马神经元的选择性生长。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
方法文章
从海马组织样本中分离与培养神经元
1K 次观看
⸱
2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。
1. 孕鼠/大鼠海马神经元的分离、解离与培养
- 用于培养的海马神经元的分离与解离
- 解冻蛋白酶溶液（3 mg/mL 蛋白酶 23 溶于切片分离液中， SLDS 表1）并预热铺板培养基（表 2在 37 °C 下。
- 分离海马组织，并用SLDS冲洗。
注意： 四个海马体可提供足够用于一个24孔板或一个6孔板的细胞。 - 去除SLDS，加入2 mL蛋白酶溶液，将样品在37 °C、5% CO₂条件下孵育2，15分钟。
- 用5–10 mL铺板培养基洗涤海马体外植体两次，每次加入5 mL铺板培养基。使用带有1 mL塑料吸头的移液器产生轻微涡流，将海马体外植体解离成单细胞。上下吹打约40次，避免产生氧气气泡，直至溶液变浑浊且无明显的大块外植体残留。
注意： 洗涤过程中需保留部分培养基，海马组织外植块在整个操作过程中应始终保持浸没在培养基中。 - 以1,125 × g离心3分钟。移除上清液时保持细胞浸没在培养基中。将细胞重悬于145 mL铺板培养基中。取1 mL细胞悬液加入24孔板每孔（或取3 mL加入6孔板每孔）。
注意： 使用145 mL铺板培养基制备低细胞密度的细胞悬液。该体积可用于将细胞接种至六块24孔板、八块6孔板，或根据实验需求选择不同组合的24孔板和6孔板。每孔24孔板中的细胞数量约为3 × 104 细胞 - 在37 °C、5% CO₂条件下，将细胞置于铺板培养基中孵育2 孵育2-4小时后，移除所有铺板培养基，并更换为新鲜的维持培养基。
- 2天后（2天 体外，第2天体外培养时，用含2 µM Ara-C（阿糖胞苷）的维持培养基替换一半培养液，以抑制成纤维细胞、内皮细胞和胶质细胞的生长。细胞经Ara-C处理两天后，更换为新鲜的维持培养基。
表1：盖玻片包被溶液。 提供用于制备盖玻片包被溶液的配方，该溶液用于将培养的细胞黏附于盖玻片上。
| 盖玻片包被溶液 | |
| 780 µL | 乙酸 17 mM 储存液：将 50 µL 乙酸加入 50 mL H2O 中 |
| 200 µL | 聚-D-赖氨酸（0.5 mg/mL 储存液） |
| 20 µL | 大鼠尾胶原蛋白（3 mg/mL 储存液） |
| 总体积根据需包被的盖玻片数量确定。 | |
表2：细胞培养基配方。 提供用于原代海马神经元细胞培养的培养基配制方法。
| 1x 切片解剖溶液（SLDS），过滤，pH = 7.4，4 °C 保存 | |
| 1 L | ddH2O |
| 82 mM | Na2SO4 |
| 30 mM | K2SO4 |
| 10 mM | HEPES（游离酸） |
| 10 mM | D-葡萄糖 |
| 5 mM | MgCl2 |
| 0.00% | 酚红（可选） |
| 铺板培养基（PM，过滤，4 °C 保存） | |
| 439 mL | MEM Earle's 盐溶液 |
| 50 mL | FBS |
| 11.25 mL | 20% D-葡萄糖 |
| 5 mL | 丙酮酸钠（100 mM） |
| 62.5 µL | L-谷氨酰胺（200 mM） |
| 5 mL | 青霉素/链霉素（P/S，100x） |
| 维持培养基（MM，过滤，4 °C 保存） | |
| 484 mL | Neurobasal |
| 10 mL | B27 50x 添加剂 |
| 1.25 mL | L-谷氨酰胺（200 mM） |
| 5 mL | 100x P/S |
| 所有溶液均使用孔径为 0.2 mm 的滤膜进行灭菌。 | |
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 12 mm 盖玻片 | Warner Instruments | 64-0702 | 用于 24 孔板 |
| 25 mm 盖玻片 | Fisher Scientific | 12-545-102 | 用于 6 孔板 |
| 乙酸 | Fisher Scientific | A38-212 | |
| 聚-D-赖氨酸 | Sigma | P6407 | |
| 大鼠尾胶原蛋白 | Roche | 11 179 179 001 | |
| 10X PBS | National Diagnostics | CL-253 | |
| Na₂SO₄ | Fisher Scientific | S373-500 | |
| K₂SO₄ | Fisher Scientific | P304-500 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP410-500 | |
| D-葡萄糖 | Fisher Scientific | D16-500 | |
| MgCl₂ | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| NaOH | Fisher Scientific | SS255-1 | |
| 蛋白酶 | Sigma | P4032 | |
| FBS | Gibco | 26140 | |
| 丙酮酸钠 | Gibco | 11360-070 | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | 25030081 | |
| 青霉素/链霉素 100x (P/S) | Gibco | 15140122 | |
| MEM Earle's 盐 | Gibco | 11090 | |
| B27 添加剂 | Gibco | 17504-044 | |
| Neurobasal 培养基 | Gibco | 21103-049 | |
| 阿糖胞苷 (Ara-C) | Sigma | 147-94-4 | |
| Opti-MEM 培养基 | Gibco | 31985-070 |
标签
