从海马组织样本中分离与培养神经元

摘要

来源：Servello, D. 等，用于研究中枢神经元轴突曲张体形成与恢复的微生物力学系统。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频演示了使用酶解法和机械解离法从海马组织样本中分离和培养海马神经元。使用阿糖胞苷（Ara-C）处理可抑制非神经元细胞的生长，从而促进海马神经元的选择性生长。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 孕鼠/大鼠海马神经元的分离、解离与培养

1. 用于培养的海马神经元的分离与解离
   1. 解冻蛋白酶溶液（3 mg/mL 蛋白酶 23 溶于切片分离液中， SLDS 表1）并预热铺板培养基（表 2在 37 °C 下。
   2. 分离海马组织，并用SLDS冲洗。
      注意： 四个海马体可提供足够用于一个24孔板或一个6孔板的细胞。
   3. 去除SLDS，加入2 mL蛋白酶溶液，将样品在37 °C、5% CO₂条件下孵育₂，15分钟。
   4. 用5–10 mL铺板培养基洗涤海马体外植体两次，每次加入5 mL铺板培养基。使用带有1 mL塑料吸头的移液器产生轻微涡流，将海马体外植体解离成单细胞。上下吹打约40次，避免产生氧气气泡，直至溶液变浑浊且无明显的大块外植体残留。
      注意： 洗涤过程中需保留部分培养基，海马组织外植块在整个操作过程中应始终保持浸没在培养基中。
   5. 以1,125 × g离心3分钟。移除上清液时保持细胞浸没在培养基中。将细胞重悬于145 mL铺板培养基....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
12 mm 盖玻片	Warner Instruments	64-0702	用于 24 孔板
25 mm 盖玻片	Fisher Scientific	12-545-102	用于 6 孔板
乙酸	Fisher Scientific	A38-212
聚-D-赖氨酸	Sigma	P6407
大鼠尾胶原蛋白	Roche	11 179 179 001
10X PBS	National Diagnostics	CL-253
Na₂SO₄	Fisher Scientific	S373-500
K₂SO₄	Fisher Scientific	P304-500
HEPES	Fisher Scientific	BP410-500
D-葡萄糖	Fisher Scientific	D16-500
MgCl₂	Fisher Scientific	BP214-500
NaOH	Fisher Scientific	SS255-1
蛋白酶	Sigma	P4032
FBS	Gibco	26140
丙酮酸钠	Gibco	11360-070
L-谷氨酰胺	Gibco	25030081
青霉素/链霉素 100x (P/S)	Gibco	15140122
MEM Earle's 盐	Gibco	11090
B27 添加剂	Gibco	17504-044
Neurobasal 培养基	Gibco	21103-049
阿糖胞苷 (Ara-C)	Sigma	147-94-4
Opti-MEM 培养基	Gibco	31985-070