将人类胚胎干细胞分化为少突胶质细胞

摘要

来源：Assetta, B.，等。利用多能干细胞生成人类神经元和少突胶质细胞以模拟神经元-少突胶质细胞相互作用。J. Vis. Exp (2020)。

本视频展示了如何从人类胚胎干细胞生成少突胶质细胞前体细胞（OPCs），随后将OPCs成熟为少突胶质细胞。该少突胶质细胞生成过程为改善包括阿尔茨海默病在内的神经退行性疾病的研究与治疗开辟了众多途径。

方案

1. 多能干细胞诱导人少突胶质前体细胞（OPC）及少突胶质细胞成熟

1. 神经前体细胞（NPC）的生成：单层培养法（约7天）。流程图见图1A。
   1. 使用商业化获得的H1人类胚胎干细胞，传代次数为52代（见材料表）。将细胞培养于包被了细胞外基质溶液的6孔板上（每6孔板约0.5 mg基质溶液；见材料表），使用胚胎干细胞维持培养基（见材料表），在37 °C、5% CO₂条件下孵育。
   2. 通过一种称为双SMAD抑制（dual SMADi）的成熟方法，使用小分子抑制剂靶向多个信号通路，将细胞转分化为神经前体细胞（NPCs）。此处我们采用一种广泛认可的商业化试剂盒，并遵循制造商提供的单层培养方案（见材料表）。
   3. 在第-1天，将0.5–1 × 10⁶个细胞/孔接种于包被了低生长因子基质溶液的6孔板中（见材料表；每6孔板约0.5 mg基质溶液），使用胚胎干细胞（ES）维持培养基（见材料表）。该低生长因子基质溶液用于包被后续所有步骤中使用的培养板。
   4. 在第0天，使用添加了2%二甲基亚砜（DMSO）的胚胎干细胞维持培养基（见材料表）处理细胞24小时。
   5. 在第1–6天，更换为预热至37 °C的神经诱导培养基（含试剂盒提供的SMAD抑制剂，见材料表）。若细胞在第7天前已增殖至汇合状态，则按步骤1.1.3所述方法以0.5–1 × 10⁶的接种密度进行传代。
   6. 在第7天，使用细胞解离溶液（见材料表）将NPCs传代，并以1–2 × 10⁵个细胞/孔的密度接种至24孔板中。
   7. 通过免疫组织化学（IHC）染色检测分化效率，确认多能性标志物（如OCT4）的缺失，以及NPC标志物（如PAX6、Nestin和Sox1）的表达。
   8. 在此阶段，解离后的NPCs可使用专用的商业化NPC冻存培养基（见材料表）冻存，并在液氮中保存长达3个月。经历一次冻融后，NPCs仍能保持多向分化潜能，可通过可靠方案分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质前体细胞（OPCs）。
2. 少突胶质前体细胞（OPC）的生成（约7天）。流程图见图1A。
   1. 在第7天，使用细胞解离溶液（见材料表）将NPCs传代，并以1–2 × 10⁵个细胞/孔的密度接种至24孔板中，使用预热（37 °C）的神经诱导培养基（含试剂盒提供的SMAD抑制剂，见材料表）进行培养。
   2. 在第8天，配制含1% DMSO的OPC分化培养基溶液，并处理已接种的NPCs 24小时。OPC分化培养基的组成为：基础培养基（DMEM/F12）、1% N2补充剂、1% B27补充剂、20 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、1 µM平滑受体激动剂（SAG）、10 ng/mL血小板源性生长因子（PDGF-AA）（见材料表）。
   3. 在第9天，更换为不含DMSO的新鲜OPC分化培养基。每隔一天换液一次，直至第15天。若细胞在第15天前达到汇合状态，则按步骤1.2.1所述方法以1–2 × 10⁵个细胞/孔的密度传代。
   4. 在第14天，将OPCs以1–2 × 10⁵个细胞/孔的密度接种于24孔板中，使用OPC分化培养基培养。
   5. 在第15天，通过免疫组织化学（IHC）染色或定量聚合酶链式反应（qPCR）检测细胞中OPC特异性标志物的表达（如O4、Olig1/2、CSPG4/Ng2、NKX2.2、PDGFRa；图1B），并确认NPC标志物（Pax6或Nestin；图1D）的缺失。通常在第15天可检测到超过95%的细胞呈现O4免疫反应阳性。与阿尔茨海默病密切相关的是，APP（淀粉样前体蛋白）、BACE1（β-分泌酶1）以及淀粉样β肽（Aβ）在OPCs中表达丰富（图1F）。
3. 少突胶质细胞（OL）成熟（约7–20天）
   1. 在第15天，更换为OL成熟培养基：Neurobasal-A培养基、2% B27补充剂、1 µM环磷酸腺苷（cAMP）、200 ng/mL三碘甲腺原氨酸（T3）以及1 µM Clemastine（见材料表）。每隔一天或根据需要每天更换培养基。
   2. 当细胞达到90%汇合时，以1:3比例传代，最多传代2次，或直至细胞增殖显著减缓。若OPCs增殖过快并在少于3天内达到汇合状态，可加入Ara-C（见材料表），浓度为2–5 µM，处理1–3天。活跃的增殖表明成熟效率降低。
   3. 通过检测OL标志物（如CLDN11、PLP1、MBP）的表达水平（采用qPCR、IHC染色或免疫印迹法）评估少突胶质细胞成熟的效率。在第28天应能明显观察到高度复杂的细胞形态特征（图1C）以及OL标志物的表达（图1E）。

结果

图1：iOPC（诱导少突胶质前体细胞）的生成与iOL（诱导少突胶质细胞）的成熟。（A）iOPC与iOL生成的流程图。（B）第15天iOPC的代表性明场与免疫荧光图像。Olig2（少突胶质谱系广谱标志物）显示为绿色，O4（OPC标志物）显示为红色，DAPI显示为蓝色。成像结果显示，>95%的iOPC表达O4，25%表达Olig2。（C）第28天iOL的代表性明场与免疫荧光图像。MBP显示为绿色，O1显示为红色，DAPI显示为蓝色。（D）在第14天iOPC中，NPC标志物PAX6的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Accutase	STEMCELL Technologies	7920
B27 添加剂	ThermoFisher	17504044
bFGF	ThermoFisher	PHG 0266
cAMP	MilliporeSigma	A9501
氯马斯汀	MilliporeSigma	SML0445
DMEM/F12 培养基	STEMCELL Technologies	36254
DMSO	ThermoFisher	D12345
胎牛血清	ScienCell	10
H1 人胚胎干细胞	WiCell	WA01
Matrigel	Corning	354234
mTeSR plus	STEMCELL Technologies	5825
N2 添加剂	ThermoFisher	17502001
Neurobasal A 培养基	ThermoFisher	10888-022
非必需氨基酸	ThermoFisher	11140-050
PDGF-AA	R&D Systems	221-AA-010
pMDLg/pRRE	Addgene	12251
聚凝胺	MilliporeSigma	TR-1003-G
pRSV-REV	Addgene	12253
ROCK 抑制剂 Y-27632	STEMCELL Technologies	72302
SAG	Tocris	4366
STEMdiff 神经前体细胞冻存培养基	STEMCELL Technologies	5838
STEMdiff SMADi 神经诱导试剂盒	STEMCELL Technologies	8581
T3 三碘甲腺原氨酸	MilliporeSigma	T6397
Tempo-iOlogo：人iPSC来源的少突前体细胞	Tempo BioScience	SKU102
TetO-Ng2-Puro	Addgene	52047
VSV-G	Addgene	12259