一种用于模拟神经元-少突胶质细胞相互作用的共培养方法

摘要

来源：Assetta, B.,等 利用多能干细胞生成人类神经元和少突胶质细胞以模拟神经元-少突胶质细胞相互作用。J. Vis. Exp. (2020)。

本视频展示了人源诱导神经元（iNs）与诱导少突胶质前体细胞（iOPCs）共培养体系的建立。将iNs与iOPCs混合后进行共培养，并孵育以促进iNs向神经元、iOPCs向少突胶质细胞的成熟。神经元与其他神经元及少突胶质细胞形成突触连接，而少突胶质细胞则在神经元轴突周围发育出髓鞘结构。

方案

1. 由人多能干细胞诱导人神经元

1. 慢病毒制备（约5天）
   1. 在每瓶T75培养瓶中接种约100万个人类胚胎肾293T（HEK293T）细胞，使转染时细胞汇合度约为40%。用表达四环素诱导型神经源性基因2（Ngn2）和嘌呤霉素抗性基因（PuroR；均受同一四环素操纵子（TetO）启动子调控）、反向四环素转录激活因子（rtTA）以及三种辅助质粒pRSV-REV、pMDLg/pRRE和VSV-G的质粒共转染细胞（慢病毒载体DNA为12 µg，每种辅助质粒DNA为6 µg）。每次慢病毒制备至少准备三瓶培养瓶。按照生产商说明书使用聚乙烯亚胺（PEI）进行转染。16小时后更换培养基并弃去旧培养基。
   2. 连续3天每天收集含病毒颗粒的培养上清，并补充新鲜培养基。将收集的上清合并后进行病毒纯化。用0.22 µm滤器过滤病毒液，然后在49,000 × g 条件下离心90分钟。将沉淀重悬于适当体积的磷酸盐缓冲液-葡萄糖（PBS-葡萄糖）中（约150 µL）。
2. 神经元诱导（约5天）
   注意：该诱导方案（图1A；流程图）对经验证具有多能性的诱导性多能干细胞（iPS）和胚胎干细胞（ES）均非常有效（可通过已知多能性标志物的免疫组织化学染色进行检测；图1B）。
   1. 使用商....

结果

图1：由人多能干细胞（hPSCs）直接生成人诱导神经元（iNs）。（A）iN 生成的流程图。（B）起始培养的人多能干细胞（H1）的代表性明场与免疫荧光图像，用于验证其多能性。Oct4 显示为红色，Sox2 显示为绿色。（C）iNs 在第4天和第6天的代表性明场图像。（D）在纯培养条件下培养24天后，iNs 中树突分支结构和突触样斑点的典型形态，通过免疫荧光染色标记树突标志物 Map2 和突触前标志物 Synapsin 1（Syn1）进行显示。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Accutase	STEMCELL Technologies	7920
B27 添加剂	ThermoFisher	17504044
bFGF	ThermoFisher	PHG 0266
cAMP	MilliporeSigma	A9501
氯马斯汀	MilliporeSigma	SML0445
DMEM/F12 培养基	STEMCELL Technologies	36254
DMSO	ThermoFisher	D12345
强力霉素	MilliporeSigma	D3072
胎牛血清	ScienCell	10
H1 人胚胎干细胞	WiCell	WA01
Matrigel	Corning	354234
mTeSR plus	STEMCELL Technologies	5825
N2 添加剂	ThermoFisher	17502001
Neurobasal A 培养基	ThermoFisher	10888-022
非必需氨基酸	ThermoFisher	11140-050
PDGF-AA	R&D Systems	221-AA-010
PEI	VWR	71002-812
pMDLg/pRRE	Addgene	12251
聚凝胺	MilliporeSigma	TR-1003-G
pRSV-REV	Addgene	12253
嘌呤霉素	ThermoFisher	A1113803
ROCK 抑制剂 Y-27632	STEMCELL Technologies	72302
SAG	Tocris	4366
STEMdiff 神经前体细胞冻存培养基	STEMCELL Technologies	5838
STEMdiff SMADi 神经诱导试剂盒	STEMCELL Technologies	8581
T3 三碘甲腺原氨酸	MilliporeSigma	T6397
Tempo-iOlogo：人iPSC来源的少突胶质前体细胞	Tempo BioScience	SKU102
TetO-Ng2-Puro	Addgene	52047
VSV-G	Addgene	12259