一种用于模拟神经元-少突胶质细胞相互作用的共培养方法

摘要

来源：Assetta, B.,等 利用多能干细胞生成人类神经元和少突胶质细胞以模拟神经元-少突胶质细胞相互作用。J. Vis. Exp. (2020)。

本视频展示了人源诱导神经元（iNs）与诱导少突胶质前体细胞（iOPCs）共培养体系的建立。将iNs与iOPCs混合后进行共培养，并孵育以促进iNs向神经元、iOPCs向少突胶质细胞的成熟。神经元与其他神经元及少突胶质细胞形成突触连接，而少突胶质细胞则在神经元轴突周围发育出髓鞘结构。

方案

1. 由人多能干细胞诱导人神经元

1. 慢病毒制备（约5天）
   1. 在每瓶T75培养瓶中接种约100万个人类胚胎肾293T（HEK293T）细胞，使转染时细胞汇合度约为40%。用表达四环素诱导型神经源性基因2（Ngn2）和嘌呤霉素抗性基因（PuroR；均受同一四环素操纵子（TetO）启动子调控）、反向四环素转录激活因子（rtTA）以及三种辅助质粒pRSV-REV、pMDLg/pRRE和VSV-G的质粒共转染细胞（慢病毒载体DNA为12 µg，每种辅助质粒DNA为6 µg）。每次慢病毒制备至少准备三瓶培养瓶。按照生产商说明书使用聚乙烯亚胺（PEI）进行转染。16小时后更换培养基并弃去旧培养基。
   2. 连续3天每天收集含病毒颗粒的培养上清，并补充新鲜培养基。将收集的上清合并后进行病毒纯化。用0.22 µm滤器过滤病毒液，然后在49,000 × g 条件下离心90分钟。将沉淀重悬于适当体积的磷酸盐缓冲液-葡萄糖（PBS-葡萄糖）中（约150 µL）。
2. 神经元诱导（约5天）
   注意：该诱导方案（图1A；流程图）对经验证具有多能性的诱导性多能干细胞（iPS）和胚胎干细胞（ES）均非常有效（可通过已知多能性标志物的免疫组织化学染色进行检测；图1B）。
   1. 使用商品化的H1人源胚胎干细胞，传代至第52代（见材料表）。将细胞培养于包被有细胞外基质溶液的6孔板上（每6孔板使用约0.5 mg基质溶液；见材料表），使用胚胎干细胞维持培养基（见材料表），在37 °C、5% CO₂条件下孵育。
   2. 第-2天，用1 mL细胞解离液（见材料表）解离ES细胞（汇合度约80%），室温孵育10分钟。将细胞转移至离心管中，用2 mL培养基冲洗培养孔并将冲洗液合并至同一离心管。在300 × g 条件下离心5分钟，弃上清后将沉淀重悬于培养基中，并以每孔1 × 10⁵个细胞的接种密度接种至包被基质的6孔板中。
   3. 第-1天，在新鲜的胚胎干细胞维持培养基（见材料表）中加入表达Ngn2和PuroR的慢病毒、rtTA病毒以及多聚素（polybrene，8 µg/mL）。具体病毒用量应根据实际滴度或滴定结果确定。通常每6孔板每孔加入5 µL病毒。
   4. 第0天，在含N2添加剂但不含形态发生因子的杜尔贝科改良伊格尔培养基/营养混合物F-12（DMEM-F12）中加入多西环素（2 µg/mL），以激活Ngn2表达。
   5. 第1天，在含N2添加剂和多西环素的新鲜DMEM-F12培养基中加入嘌呤霉素，终浓度为1 µg/mL。用嘌呤霉素筛选转导细胞至少24小时。若病毒滴度较低，可能需要更高的嘌呤霉素浓度（最高达5 µg/mL）和更长的筛选时间（最长48小时），以充分清除未充分转导的细胞。
   6. 第2天，用细胞解离液（见材料表）解离正在分化的神经元，重新接种至包被有基质溶液的24孔板中（每孔80,000–200,000个细胞；见材料表），并在不含多西环素的Neurobasal-A（NBA）/B27培养基中继续培养。接种密度至关重要。
   7. 在此阶段，解离后的神经元可用特制的商品化冻存液（见材料表）冻存，并在液氮中保存最长3个月。解冻后可根据典型的约15%–20%的细胞死亡率调整接种量，纯化的神经元可单独培养或与其他脑细胞类型共培养（共培养操作见步骤3.2.3.，与少突胶质前体细胞OPCs共培养）。
   8. 将纯化的诱导神经元（iNs）培养于按制造商说明包被有基于细胞外基质溶液的培养板上（见材料表）。典型的锥体样形态在第4天（及第6天；图1C）应已明显可见。通过标准的突触前和突触后标志物免疫组织化学染色，最早可在第14至16天检测到突触形成，第24天时突触形成显著（图1D；以突触前标志物Synapsin 1和树突标志物Map2标记）。

2. 多能干细胞诱导人少突胶质前体细胞（OPCs）及少突胶质细胞成熟

1. 神经前体细胞（NPC）的生成：单层培养法（约7天）。流程图见图2A。
   1. 按照前述方法培养H1人胚胎干细胞（见步骤1.2.1），并通过一种称为双抑制SMAD（dual SMADi）的成熟方法将其转分化为神经前体细胞（NPCs），该方法使用针对多个信号通路的小分子抑制剂。此处我们采用一种广泛认可的商用试剂盒，并遵循制造商提供的单层培养方案（见材料表）。
   2. 第-1天，在6孔板中接种0.5–1 × 10⁶个细胞/孔，孔板预先用生长因子减活基质溶液包被（见材料表；每6孔板约0.5 mg基质溶液），使用胚胎干细胞维持培养基（见材料表）。该生长因子减活基质溶液用于包被后续所有步骤中将使用的培养板。
   3. 第0天，用添加2% DMSO的胚胎干细胞维持培养基（见材料表）处理细胞24小时。
   4. 第1–6天，更换为温热（37 °C）的神经诱导培养基（含商用试剂盒中的SMAD抑制剂，见材料表）。若细胞在第7天前已分裂并达到汇合状态，按步骤2.1.2所述方法传代，接种密度为0.5–1 × 10⁶个细胞/皿。
   5. 第7天，使用细胞解离液（见材料表）将NPCs传代，并以1–2 × 10⁵个细胞/孔的密度接种至24孔板中。
   6. 通过免疫组织化学（IHC）染色检测分化效率，验证多能性标志物（如八聚体结合转录因子4 [OCT4]）的缺失，以及NPC标志物（如配对盒6 [PAX6]、Nestin、Y染色体性别决定区转录因子1 [Sox1]）的表达。
   7. 在此阶段，解离后的NPCs可使用专用的商用NPC冻存培养基（见材料表）冻存，并在液氮中保存长达3个月。经历一次冻融后，NPCs仍能保持多向分化潜能，可通过可靠方案分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质前体细胞（OPCs）。
2. 少突胶质前体细胞（OPC）的生成（约7天）。流程图见图2A。
   1. 第7天，使用细胞解离液（见材料表）将NPCs传代，并以1–2 × 10⁵个细胞/孔的密度接种至24孔板中，培养基为温热（37 °C）的神经诱导培养基，添加商用试剂盒中的SMAD抑制剂（见材料表）。
   2. 第8天，配制含1%二甲基亚砜（DMSO）的OPC分化培养基溶液，处理已接种的NPCs 24小时。OPC分化培养基的组成为：DMEM/F12培养基、1% N2补充剂、1% B27补充剂、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）20 ng/mL、平滑受体激动剂（SAG）1 µM、血小板源性生长因子-AA（PDGF-AA）10 ng/mL（见材料表）。
   3. 第9天，更换为不含DMSO的新鲜OPC分化培养基。每隔一天换液一次，直至第15天。若细胞在第15天前达到汇合状态，按步骤2.2.1所述方法传代，接种密度为1–2 × 10⁵个细胞/孔。
   4. 第14天，将OPCs以1–2 × 10⁵个细胞/孔的密度接种至24孔板中，使用OPC分化培养基。
   5. 在此阶段（第15天），通过IHC染色或qPCR检测细胞中OPC特异性标志物的表达（如O4、少突胶质细胞谱系转录因子[Olig]-1/2、硫酸软骨素蛋白聚糖4/神经胶质抗原2 [CSPG4/Ng2]、NK2同源框2 [NKX2.2]、血小板源性生长因子受体α [PDGFRa]；图2B），并验证NPC标志物（Pax6或Nestin；图2D）的缺失。通常在第15天，超过95%的细胞可检测到O4免疫反应性。与阿尔茨海默病密切相关的是，OPCs中淀粉样前体蛋白（APP）、β-分泌酶1（BACE1）以及淀粉样β肽（Aβ）的表达丰度较高（图2F）。

3. 人类诱导神经元（iNs）与少突胶质前体细胞（iOPCs）的共培养

1. iOPC 铺板（约 3 天）
   1. 在第 14 天，以每孔 1 × 10⁵ 个细胞的密度将 iOPC 接种至 24 孔板中（如上文步骤 2.2.4 所述），使用 OPC 分化培养基（如步骤 2.2.2 所述）。
2. iN-iOPC 共培养体系建立
   1. 在第 15 天，使用细胞解离液（见材料表）将经过嘌呤霉素筛选后第 2 天的诱导人神经元（如步骤 1.2.6 所述）从培养皿中解离下来。
   2. 将神经元接种到已培养的 OPC 上，以每孔 2 × 10⁵ 个细胞的接种密度加入含有生长中 OPC 的 24 孔板（来自步骤 3.1.1）。使用含有 Neurobasal-A 培养基、2% B27 添加物和 100 ng/mL 三碘甲腺原氨酸（T3）的共培养培养基。次日更换培养基，之后每隔一天换液一次。若 OPC 增殖过快，在不到 3 天内达到汇合状态，可加入浓度为 2–5 µM 的阿糖胞苷（Ara-C）。共培养 7 天后 iN 与 iOPC 的代表性图像见图 3A。
   3. 使用如上文步骤 1.2.7 所述制备的冻存神经元与 OPC 进行共培养。冻融神经元的接种密度应更高，为每孔 3 × 10⁵ 个细胞。
   4. 共培养第 14–16 天后，可通过突触前和突触后标志物的免疫组化染色观察 iN 中的突触形成情况；至第 21 天，突触斑点应已大量出现（图 3C），并可稳定记录神经元活动。
   5. 从第 21 天开始，检测细胞中少突胶质细胞特异性标志物（例如髓鞘碱性蛋白 [MBP] 和蛋白脂质蛋白 1 [PLP1]）。通常在第 28 天可观察到 iOL 突起包绕 iN 轴突的现象，该现象可通过特异性标志物的免疫组化染色进行标记（图 3B；神经丝蛋白 [NF] 标记 iN 轴突，MBP 标记 iOPC 突起）。

结果

图1：由人多能干细胞（hPSCs）直接生成人诱导神经元（iNs）。（A）iN 生成的流程图。（B）起始培养的人多能干细胞（H1）的代表性明场与免疫荧光图像，用于验证其多能性。Oct4 显示为红色，Sox2 显示为绿色。（C）iNs 在第4天和第6天的代表性明场图像。（D）在纯培养条件下培养24天后，iNs 中树突分支结构和突触样斑点的典型形态，通过免疫荧光染色标记树突标志物 Map2 和突触前标志物 Synapsin 1（Syn1）进行显示。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Accutase	STEMCELL Technologies	7920
B27 添加剂	ThermoFisher	17504044
bFGF	ThermoFisher	PHG 0266
cAMP	MilliporeSigma	A9501
氯马斯汀	MilliporeSigma	SML0445
DMEM/F12 培养基	STEMCELL Technologies	36254
DMSO	ThermoFisher	D12345
强力霉素	MilliporeSigma	D3072
胎牛血清	ScienCell	10
H1 人胚胎干细胞	WiCell	WA01
Matrigel	Corning	354234
mTeSR plus	STEMCELL Technologies	5825
N2 添加剂	ThermoFisher	17502001
Neurobasal A 培养基	ThermoFisher	10888-022
非必需氨基酸	ThermoFisher	11140-050
PDGF-AA	R&D Systems	221-AA-010
PEI	VWR	71002-812
pMDLg/pRRE	Addgene	12251
聚凝胺	MilliporeSigma	TR-1003-G
pRSV-REV	Addgene	12253
嘌呤霉素	ThermoFisher	A1113803
ROCK 抑制剂 Y-27632	STEMCELL Technologies	72302
SAG	Tocris	4366
STEMdiff 神经前体细胞冻存培养基	STEMCELL Technologies	5838
STEMdiff SMADi 神经诱导试剂盒	STEMCELL Technologies	8581
T3 三碘甲腺原氨酸	MilliporeSigma	T6397
Tempo-iOlogo：人iPSC来源的少突胶质前体细胞	Tempo BioScience	SKU102
TetO-Ng2-Puro	Addgene	52047
VSV-G	Addgene	12259