一种从诱导性多能干细胞生成小脑细胞二维单层培养的技术

摘要

来源：Madencioglu, D. A., 等模拟人类小脑发育体外二维结构中。 J. Vis. Exp. (2022).

本视频展示了一种将人诱导性多能干细胞分化为小脑前体细胞的实验方案。该方案包括将干细胞克隆转移至超低吸附培养板以形成类胚体，利用生长因子促进其分化，随后将类胚体转移至基质包被的培养板以实现贴壁。后续步骤包括诱导细胞迁移，并添加成熟培养基，以引导谷氨酸能和GABA能小脑神经前体细胞以及浦肯野细胞前体的发育。

方案

1. 实验准备

制备包被基底膜基质（BMM）的培养板。
注意： BMM在较高温度下凝固更快。必须快速制备培养板，并立即置于4 °C保存。
1. 将BMM（参见材料表）在冰上或4 °C条件下解冻至少2小时，或过夜。
2. 将Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）/F12与BMM混合，终浓度为80 µg/mL。将BMM溶液分装至组织培养皿中（35 mm培养皿加1 mL，60 mm培养皿加2 mL），在接种细胞前于37 °C孵育至少1小时或过夜。
  注意： 未使用的培养皿可在4 °C保存2周。
制备多聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白（PLO/层粘连蛋白）包被的培养板。
1. 用无菌Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS+/+）配制20 µg/mL的PLO（参见材料表），每孔加入1 mL至6孔板中。在培养箱中37 °C孵育过夜。
2. 次日，用真空吸液器吸除PLO溶液，并用DPBS+/+洗涤两次。在生物安全柜中自然晾干。
  注意： 晾干后的培养板可用铝箔包裹，在4 °C保存长达2周，以备后续使用。
3. 用DPBS+/+配制10 µg/mL的层粘连蛋白（参见材料表），每孔加入1 mL至6孔板中。在培养箱中37 °C孵育至少3小时或过夜。
4. 用真空吸液器吸除层粘连蛋白溶液，每孔加入1 mL培养基或无菌DPBS+/+。
  注意： 层粘连蛋白包被表面不得干燥。应立即加入PBS或适当的培养基以防止干燥。包被后的培养板可在4 °C保存长达2周。
制备多能干细胞（PSC）传代溶液。
1. 将11.49 g氯化钾（KCl）和0.147 g柠檬酸钠二水合物（HOC(COONa)(CH₂COONa)₂*2H₂O）溶解于400 mL无菌细胞培养级水中（参见材料表）。
2. 测量溶液总体积，并记录为初始体积（Vi）。
3. 测定渗透压，并通过添加无菌细胞培养级水调节至570 mOsm，使用公式 Vi × Oi = Vf × 570 mOsm 进行计算。
4. 用0.20 µm滤器过滤除菌，分装为10 mL等份。室温（RT）保存，最长可达6个月。
制备多能干细胞（PSC）培养基。
注意： 诱导性多能干细胞（iPSC）在含有耐热型成纤维细胞生长因子2（FGF2）的培养基中维持培养（参见材料表），可实现无需周末换液的培养方案。本实验方案未尝试其他市售PSC培养基。
1. 将PSC培养基添加剂在4 °C条件下过夜解冻。
2. 将10 mL PSC培养基添加剂加入500 mL基础PSC培养基中。分装为25 mL等份，于−20 °C保存。
  注意： 冻存的等份样品可在−20 °C保存6个月。解冻后的等份样品必须保存在4 °C，并在2周内使用完毕。细胞可使用含10%（v/v）二甲基亚砜（DMSO）的PSC培养基进行冷冻，用于长期保存。
制备PSC解冻培养基。
1. 在PSC培养基中添加50 nM chroman、1.5 µM emricasan、1x 多胺补充剂和0.7 µM trans-ISRIB（CEPT混合物）（参见材料表）。
2. 用0.20 µm滤器过滤除菌，在4 °C保存，最长可达4周。
制备拉制玻璃移液管。
1. 在本生灯上方将22.9 cm（9英寸）长的玻璃巴斯德移液管拉成两段，位置约在颈部下方2 cm处，形成两根移液管，其中较细的一段比另一段短约4 cm。
2. 借助火焰将拉细端的尖端弯曲，形成平滑的“r”形。
3. 将拉制好的移液管放入高压灭菌袋中，进行高压灭菌以实现灭菌。
制备小脑分化培养基（CDM）。
1. 将Iscove改良Dulbecco培养基（IMDM）与Ham's F12营养混合物按1:1比例混合。向混合液中添加1x L-丙氨酰-L-谷氨酰胺补充剂、1%（v/v）化学成分明确的脂质浓缩液、0.45 mM 巯基甘油、15 µL/mL 去铁转铁蛋白、5 mg/mL 牛血清白蛋白（BSA）和7 µg/mL 胰岛素（参见材料表）。
2. 用0.20 µm滤器过滤除菌，4 °C保存，并在1个月内使用完毕。
制备小脑成熟培养基（CMM）。
1. 在Neurobasal培养基中添加1x L-丙氨酰-L-谷氨酰胺补充剂和1x N-2补充剂（参见材料表）。
2. 用0.20 µm滤器过滤除菌，4 °C保存，并在2周内使用完毕。

2. 无饲养层iPSC培养

按照以下步骤解冻细胞。
1. 将BMM培养板（步骤1.1）放入37 °C培养箱中，使其凝胶化至少1小时或过夜，然后再解冻细胞。
2. 在37 °C下预热10 mL PSC解冻培养基（步骤1.5）。
3. 将装有细胞的冻存管从液氮中转移至37 °C水浴中。
  注意：为避免在细胞培养环境中产生污染源，不建议使用标准水浴。相反，可将新鲜水在小烧杯中加热至37 °C，制成一次性使用的水浴。
4. 当冻存管中仅剩一小块冰时，将其从水浴中取出，擦干管体，并喷洒70%乙醇。将冻存管转移至超净台，使用2 mL或5 mL移液管（见材料表）轻轻将细胞转移至15 mL锥形离心管中。
5. 在轻轻旋转锥形管的同时，逐滴加入8 mL PSC解冻培养基。在室温下以200 × g离心5分钟。
6. 使用真空抽吸装置小心吸除上清液，注意不要扰动细胞沉淀。将细胞沉淀重悬于2 mL PSC解冻培养基中。
7. 吸除培养板中的BMM，然后将重悬的细胞逐滴均匀地加入培养板中。
8. 将培养板置于37 °C、5% CO₂的培养箱中。次日更换为PSC培养基。此后每天更换一次培养基。
按照以下步骤维持细胞培养。
1. 在37 °C下预热所需体积的PSC培养基（例如，每35 mm培养板使用1 mL培养基）。
2. 观察培养板中是否存在分化细胞或克隆，并使用拉制玻璃移液管（步骤1.6）去除分化细胞。
  注意：iPSC克隆具有光滑的边缘，细胞形态一致。
3. 每天更换耗尽的培养基，并每3–4天传代一次，或在达到70%汇合度时进行传代。
传代细胞。
1. 在传代前至少1小时或过夜，将所需数量的BMM培养板放入培养箱中。在37 °C下预热所需量的PSC培养基（步骤1.3）。
2. 使用拉制玻璃移液管清除任何分化细胞或克隆。
3. 使用真空抽吸装置吸除耗尽的培养基，然后加入PSC解离培养基，每35 mm培养皿加1 mL。在37 °C下孵育1–3分钟。
  注意：如果在加入PSC培养基前，克隆已在PSC传代溶液中脱落，可缩短孵育时间。
4. 吸除PSC传代溶液，加入预热的PSC培养基。
5. 使用无菌的200 µL移液枪头，在一个方向上平行划线，然后将培养板旋转90°，再划一组与之前垂直的划线（在培养板上形成交叉网格图案）。
6. 从设定好的培养板中吸除BMM溶液。使用移液管收集克隆，并将其分配至新的BMM培养板中。
7. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育。每天更换培养基。
冻存细胞。
1. 通过标记冻存管内容物并在超净台中用紫外光（UV）灭菌30分钟来准备冻存管（见材料表）。
2. 通过在PSC培养基中添加10%（v/v）DMSO制备PSC冻存培养基。按照步骤2.3.2–2.3.5操作。
3. 使用5 mL移液管将细胞转移至15 mL锥形离心管中，并在室温下以200 × g离心5分钟。
4. 小心吸除培养基，并将细胞沉淀重悬于PSC冻存培养基中。
5. 分装至冻存管中。将冻存管放入冻存盒，并将冻存盒置于−80 °C冰箱中。
6. 次日，将冻存管转移至液氮中进行长期保存。

3. 小脑分化

注意：开始分化前，将iPSCs传代至六个35 mm培养皿中，当细胞达到70%融合度时即可进行分化。每个35 mm培养皿将转移至6孔板中的一个孔。

第0天，将健康的iPSC集落转移至悬浮培养以形成拟胚体（EB）。
1. 向6孔超低吸附（ULA）培养板的每孔中加入1 mL CDM培养基（见步骤1.7），并补充10 µM Y-27632和10 µM SB431542（参见材料表），放入培养箱中预温，直至待转移的集落准备就绪后加入各孔。
2. 使用拉制的玻璃移液管清除已分化的细胞。吸除培养基后，每35 mm培养皿加入1 mL PSC传代溶液。在37 °C下孵育3分钟，随后吸除溶液，并加入2 mL补充有10 µM Y-27632和10 µM SB431542的CDM培养基。
  注意：若在加入CDM前集落已在PSC传代溶液中脱落，可适当缩短孵育时间。
3. 在透射光倒置显微镜下，使用4倍物镜，用拉制玻璃移液管的弯曲边缘轻柔地将集落挑起。待所有集落均被挑起后，使用10 mL血清移液管将其全部轻柔转移至6孔ULA培养板的一个孔中。对每个iPSC培养皿重复此操作。将细胞置于37 °C、5% CO₂条件下培养。
  注意：若集落过大或已融合，可用拉制玻璃移液管的尖端将其切分为更小的EB。
第2天，向每孔加入FGF2，使其终浓度达到50 ng/mL。
注意：用于小脑分化的FGF2不耐热。本实验方案未使用耐热型FGF2进行测试。
第7天，进行1/3体积的换液。每孔总培养体积为3 mL时，使用1,000 µL移液器轻柔吸除1 mL用过的培养基，并补充1 mL新鲜CDM培养基。继续将EB培养7天。
第14天，使用1,000 µL移液器轻柔吸除绝大部分用过的培养基。为尽量减少对EB的损伤，轻轻晃动培养板使所有EB聚集于孔中央，然后倾斜培养板，从边缘缓慢吸除液体。
1. 随着液体量减少，缓慢将培养板放平并继续吸除，保留足够液体以防止EB干燥。随后加入3 mL新鲜CDM培养基，并补充10 µM Y-27632。使用10 mL血清移液管将EB转移至PLO/层粘连蛋白包被的培养皿中（见步骤1.2）。
  注意：根据后续实验需求，可将EB转移至6孔PLO/层粘连蛋白包被板中，或单个EB转移至PLO/层粘连蛋白包被的24孔板单孔或盖玻片上。
第15天，吸除培养基并更换为新鲜CDM培养基。
注意：应向各孔中加入足量培养基，以确保两次换液之间有足够的液体量，避免因长时间培养导致蒸发（例如，6孔板每孔应加入3 mL培养基）。若培养基已开始酸化（变为透明黄色），即使未到换液时间，也应立即更换，直至实验方案结束。
第21天，吸除用过的培养基并更换为CMM培养基。第28天，更换为新鲜CMM培养基。第35天，收获细胞用于后续实验。

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材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号	评论
10 mL 血清移液管	Fisher Scientific	13-678-26D
1-硫代甘油	Sigma	M6145
2 mL 血清移液管	Fisher Scientific	13-678-26B
250 mL 滤器装置，0.2 µm aPES，50 mm 直径	Fisher Scientific	FB12566502
35 mm 易握组织培养皿	Falcon	353001
5 mL 血清移液管	Fisher Scientific	13-678-25D
60 mm 易握组织培养皿	Falcon	353004
6 孔超低吸附培养板	Corning	3471
9" 一次性巴斯德吸管	Fisher Scientific	13-678-20D
脱铁转铁蛋白	Sigma	T1147
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma	A9418
细胞培养级水	Cytiva	SH30529.02
化学成分明确的脂质浓缩液	Gibco	11905031
Chroman 1	Cayman	34681
II 级 A2 型生物安全柜	NuAire, Inc.	NU-540-600	生物安全柜，带紫外灯
Costar 24 孔板，TC 处理	Corning	3526
Costar 6 孔板，TC 处理	Corning	3516
DMEM	Gibco	11965092
DMEM/F12	Gibco	11320033
DMSO（二甲基亚砜）	Sigma	D2438
DPBS+/+	Gibco	14040133
Emricasan	Cayman	22204
Epi5 附加体 iPSC 重编程试剂盒	Life Technologies	A15960
Essential 8-Flex	Gibco	A2858501	含热稳定 FGF2 的 PSC 培养基
胎牛血清 - 优质精选	Atlanta Biologicals	S11150
FGF2	Peprotech	100-18B
GlutaMAX 添加剂	Gibco	35050061	L-丙氨酰-L-谷氨酰胺添加剂
Ham's F12 营养混合物	Gibco	11765054
HERAcell VIOS 160i CO2 培养箱	Thermo Scientific	50144906
IMDM	Gibco	12440053
胰岛素	Gibco	12585
小鼠层粘连蛋白	Gibco	23017015
Matrigel 基质	Corning	354234	基底膜基质
MEM-NEAA	Gibco	11140050
迷你离心机	Labnet International	C1310	台式迷你离心机
N-2 添加剂	Gibco	17502-048
Neurobasal 培养基	Gibco	21103049
PBS，pH 7.4	Gibco	10010023
16% PFA	Electron Microscopy Sciences	15710
多胺添加剂	Sigma	P8483
聚-L-鸟氨酸（PLO）	Sigma	3655
氯化钾	Sigma	746436
SB431542	Sigma	54317
透明自封袋	Steriking	SS-T2 (90x250)	高压灭菌袋
二水合柠檬酸钠	Fisher Scientific	S279-500
注射器滤器，无菌，PES 0.22 µm，30 mm 直径	Research Products International	256131
Trans-ISRIB	Cayman	16258
蒸气压渗透压计	Wescor, Inc.	Model 5520	渗透压计
Y-27632	Biogems	1293823

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