从人诱导性多能干细胞衍生的拟胚体生成神经元和胶质细胞

摘要

来源：Pistollato, F.，等。用于神经毒性检测的人诱导多能干细胞向神经元与胶质细胞混合培养物分化的实验方案。J. Vis. Exp.(2017)

本视频演示了将拟胚体（EBs）分化为神经外胚层聚集体，并进一步将其分离为神经元和胶质细胞的过程。该方法可高效生成神经元和胶质细胞。 体外，可作为神经毒性测试中用于评估不同毒性通路的检测系统。

方案

1. 人类诱导多能干细胞向混合神经元和胶质细胞的分化

注意：该实验流程约需28天完成，主要步骤如图1所示。

1. 胚胎样体（EBs）的生成（第0 → 1天）
   注意： 该操作需要良好的手动技巧和精确性。为在后续步骤中获得均一的胚胎小体（EBs），人诱导多能干细胞（hiPSC）菌落碎片应大小一致。形态学上已分化的菌落（具有较大的细胞质比例和较小的核仁）应予以弃去。
   1. 更换 hiPSC 培养基（每 60 mm 培养皿加入 3 mL），然后进行未分化 hiPSC 克隆的切割（克隆直径约 1 mm，参见 图2A在无菌条件下。
   2. 切割未分化的集落（如图所示） 图2A 和 图 2B使用1 mL注射器配合30G针头，在室温下的超净工作台中，借助4倍放大体视显微镜将组织切割成约200 µm × 200 µm的片段。
   3. 使用200 µL移液器轻轻将培养基吹入克隆碎片下方，使其从培养皿表面脱离。
   4. 使用1、2或5 mL移液器，将所有脱落的片段和培养基转移至15 mL离心管中。
   5. 用 2 mL 完全 hiPSC 培养基冲洗培养皿，以回收所有碎片。

结果

图1：神经元分化实验方案的示意图 （上图）IMR90-hiPSC 克隆可被切割成片段以形成拟胚体（EBs）。2 天后 体外 （体外培养天数，DIV），可将拟胚体接种于层粘连蛋白或标准基质包被的培养皿中，并在神经上皮诱导（NRI）培养基中培养，以生成神经外胚层衍生物（类玫瑰花结结构，此处用巢蛋白（绿色）和β-III-微管蛋白（红色）染色标记）。类玫瑰花结结构可经解离、收集后，重新接种于层粘连蛋白或标准基质包被的培养皿中，在神经元分化（ND）培养基作用下进一步分化为成熟的神经元（NF200，红色）和胶.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
hiPSC 悬浮胚体培养基：
Knockout DMEM	Thermo-Fisher	10829-018	（步骤 2.1.7）
Knockout 血清替代物（KOSR）	Thermo-Fisher	10828-028	终浓度 20%（步骤 2.1.7）
非必需氨基酸	Thermo-Fisher	11140-035	（步骤 2.1.7）
青霉素/链霉素	Thermo-Fisher	15140-122	终浓度 50 U/mL（步骤 2.1.7）
L-谷氨酰胺 200 mM 溶液	Thermo-Fisher	25030-081	终浓度 2 mM（步骤 2.1.7）
β-巯基乙醇	Thermo-Fisher	31350-010	终浓度 50 µM（步骤 2.1.7）
完全神经上皮诱导培养基（NRI）：
DMEM/F12	Thermo-Fisher	3133-038	（步骤 2.3.1）
非必需氨基酸	Thermo-Fisher	11140-035	（步骤 2.3.1）
N2 添加剂	Thermo-Fisher	17502-048	（步骤 2.3.1）
青霉素/链霉素	Thermo-Fisher	15140-122	终浓度 50 U/mL（步骤 2.3.1）
肝素 I-A 型，≥180 USP 单位/mg	Sigma-Aldrich	H3149-100KU	终浓度 2 µg/mL（步骤 2.3.1）
bFGF	Thermo-Fisher	13256-029	使用前添加，终浓度 20 ng/mL（步骤 2.3.1）
Matrigel 基底膜基质	Corning	354234	1:100（步骤 2.2）。冰上解冻 Matrigel，分装为 200 µL 每管，储存于 -80°C。包被时，将 200 µL 分装液用 20 mL 冷 DMEM/F12 培养基稀释。
层粘连蛋白	Sigma-Aldrich	L2020	1:100（步骤 2.2）。用 1× PBS 稀释。
完全神经元分化培养基（ND）：
Neurobasal 培养基	Thermo-Fisher	21103049	（步骤 2.4.11）
B-27 添加剂（50×）	Thermo-Fisher	17504044	（步骤 2.4.11）
N2 添加剂	Thermo-Fisher	17502-048	（步骤 2.4.11）
青霉素/链霉素	Thermo-Fisher	15140-122	终浓度 50 U/mL（步骤 2.4.11）
GDNF	Thermo-Fisher	PHC7045	终浓度 1 ng/mL，使用前添加。（步骤 2.4.11）
BDNF	Thermo-Fisher	PHC7074	终浓度 2.5 ng/mL，使用前添加。（步骤 2.4.11）