从人诱导性多能干细胞衍生的拟胚体生成神经元和胶质细胞

摘要

来源：Pistollato, F.，等。用于神经毒性检测的人诱导多能干细胞向神经元与胶质细胞混合培养物分化的实验方案。J. Vis. Exp.(2017)

本视频演示了将拟胚体（EBs）分化为神经外胚层聚集体，并进一步将其分离为神经元和胶质细胞的过程。该方法可高效生成神经元和胶质细胞。 体外，可作为神经毒性测试中用于评估不同毒性通路的检测系统。

方案

1. 人类诱导多能干细胞向混合神经元和胶质细胞的分化

注意：该实验流程约需28天完成，主要步骤如图1所示。

1. 胚胎样体（EBs）的生成（第0 → 1天）
   注意： 该操作需要良好的手动技巧和精确性。为在后续步骤中获得均一的胚胎小体（EBs），人诱导多能干细胞（hiPSC）菌落碎片应大小一致。形态学上已分化的菌落（具有较大的细胞质比例和较小的核仁）应予以弃去。
   1. 更换 hiPSC 培养基（每 60 mm 培养皿加入 3 mL），然后进行未分化 hiPSC 克隆的切割（克隆直径约 1 mm，参见 图2A在无菌条件下。
   2. 切割未分化的集落（如图所示） 图2A 和 图 2B使用1 mL注射器配合30G针头，在室温下的超净工作台中，借助4倍放大体视显微镜将组织切割成约200 µm × 200 µm的片段。
   3. 使用200 µL移液器轻轻将培养基吹入克隆碎片下方，使其从培养皿表面脱离。
   4. 使用1、2或5 mL移液器，将所有脱落的片段和培养基转移至15 mL离心管中。
   5. 用 2 mL 完全 hiPSC 培养基冲洗培养皿，以回收所有碎片。
   6. 以 112 × g 离心 1 分钟。
   7. 吸弃上清液，然后在 5 mL 完全 hiPSC EB 培养基中轻柔重悬细胞团块（参见 材料表).
   8. 将菌落碎片接种于60 mm超低吸附培养皿中（每60 mm培养皿5 mL）。
   9. 在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下将培养皿孵育过夜₂.
   10. 第二天（第1天），使用1、2或5 mL移液器将拟胚体（EBs）及其培养基收集至15 mL离心管中。
   11. 将EBs在112 × g下离心1分钟。
   12. 小心吸除上清液，然后用 1、2 或 5 mL 移液器将 EBs 轻柔地重悬于 5 mL 完全 hiPSC EB 培养基中。
   13. 将EBs重新接种至新的60 mm超低吸附培养皿中（每60 mm培养皿加入5 mL）。
   14. 在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下，将培养皿孵育过夜₂.
2. 第1天，用基底膜基质包被培养皿（例如， matrigel（下文简称为“标准基质”）或其他任何合适的蛋白质基质（例如，层粘连蛋白）。
   1. 储存标准品基质（参见 材料表在-80 °C下，使用预冷的1.5 mL离心管和预冷的5或10 mL移液器，将样品分装为200 µL每份。
   2. 在冰上解冻200 µL标准基质液。
   3. 将200 µL标准基质液加入20 mL基础培养基（DMEM/F12）中稀释（1:100稀释）。
   4. 用该溶液包被60-mm培养皿（每皿5 mL）。
   5. 将包被的培养皿在37 °C孵育过夜。
      注意： 这些培养皿将用于接种胚状体（约50个/皿），以生成神经上皮细胞聚集体（玫瑰花环状结构）；参见步骤1.3。
3. 神经上皮细胞团（玫瑰花环结构）的生成（第2 → 7天）
   1. 第2天，从60 mm培养皿中移除标准基质包被液（无需冲洗培养皿），每皿加入5 mL完全神经上皮诱导培养基（NRI）；参见 材料列表.
   2. 在体视显微镜下（4倍放大）使用200 µL移液器将悬浮的EBs（来自步骤1.1.14）转移至包被的培养皿中（约50个EBs/皿），并置于超净工作台内。
      注意： 选择大小均一、中等尺寸的拟胚体（直径约200–300 µm）至关重要。过小的拟胚体在神经外胚层分化过程中存活率可能较低，而过大的拟胚体则容易发生中心坏死。
   3. 在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下培养培养皿₂.
   4. 第二天（第3天），在10倍显微镜下检查培养皿，确保所有胚状体均已贴壁。
   5. 轻柔地用完全NRI培养基进行全量换液。
   6. 每隔一天更换一次NRI培养基，直至第7天，此时应可见神经上皮细胞聚集体（玫瑰花环状结构）。
   7. 第7天，按照步骤1.2所述，将标准基质（或层粘连蛋白）包被到所需板或皿中：96孔板（每孔100 µL）、24孔板（每孔250 µL）、12孔板（每孔500 µL）、MEA芯片（用于电活动检测，每单孔芯片1 mL）或60 mm培养皿（每皿4 mL）。
   8. 将包被好的培养板/培养皿在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育至少 2 小时₂.
4. 莲状体解离与神经元分化（第8 → 28天）
   注意： 该操作需要良好的手动操作技巧和精确性。为避免收集到中胚层和内胚层细胞，仅应解离并收集外胚层类玫瑰花环结构。
   1. 第8天，在10倍放大倍数的体视显微镜下，于无菌条件下将类玫瑰花结样结构用1 mL注射器配30G针头切割成碎片。注意，当针头接触时，类玫瑰花结结构容易从培养皿上脱落。
   2. 使用 200-µL 移液器完成莲座叶丛片段的分离。
   3. 将培养皿转移至超净工作台内，使用1、2或5 mL移液器将莲座状组织碎片及其培养基收集至15 mL锥形离心管中。用2 mL NRI培养基冲洗培养皿，以回收所有碎片。
   4. 以 112 × g 离心 2 分钟，沉淀莲座叶碎片。
   5. 吸去上清液。
   6. 轻轻将沉淀重悬于1 mL 1×DPBS（不含钙和镁）中，使用1,000 µL移液器轻柔地上下吹打玫瑰花状碎片，使其部分解离。
   7. 加入4 mL完全NRI培养基，使用台盼蓝和自动细胞计数仪对细胞进行计数（参见 材料清单)
      注意： 将20 µL细胞悬液与20 µL台盼蓝混合稀释。若细胞无法充分解离为单细胞悬液，此步骤可省略。若玫瑰花环样细胞团未完全解离，可将约50个拟胚体/60 mm培养皿来源的细胞团重悬于50 mL完全NRI培养基中，并按所述方法接种。 表1.
   8. 吸出培养皿、培养板和/或MEA芯片中的标准基质（或层粘连蛋白）包被液（来自步骤1.3.7），切勿使其干燥。
   9. 根据研究计划，将细胞接种于完全NRI培养基中（约15,000个细胞/cm²）²；参见 表1 用于指示铺板体积）。
   10. 37 °C、5% CO₂ 条件下将培养板孵育过夜₂.
   11. 第10天，使用完全神经元分化培养基（ND）进行全量换液；参见材料表。
   12. 每周更换两次完全ND培养基，直至第28天。

表1.

关于解离后玫瑰花结样结构的接种密度的说明：如果玫瑰花结样结构未完全解离，为达到约15,000个细胞/cm²的接种密度，可将来自约50个拟胚体（EBs）/1个60 mm培养皿的解离后玫瑰花结样结构重悬于50 mL完全NRI培养基中，并根据培养板规格按以下方式接种：

多孔板 / 微电极阵列（MEA）	生长面积（cm²/孔）	每孔（或MEA芯片）接种的细胞悬液体积	可接种的最大板数（使用50 ml细胞悬液）
96孔	0.3	100 µl	5
48孔	0.7	220 µl	4
24孔	2	625 µl	3
12孔	4	1.25 ml	3
6孔	10	3.125 ml	2
单孔MEA芯片	3.5	1.1 ml	45

结果

图1：神经元分化实验方案的示意图 （上图）IMR90-hiPSC 克隆可被切割成片段以形成拟胚体（EBs）。2 天后 体外 （体外培养天数，DIV），可将拟胚体接种于层粘连蛋白或标准基质包被的培养皿中，并在神经上皮诱导（NRI）培养基中培养，以生成神经外胚层衍生物（类玫瑰花结结构，此处用巢蛋白（绿色）和β-III-微管蛋白（红色）染色标记）。类玫瑰花结结构可经解离、收集后，重新接种于层粘连蛋白或标准基质包被的培养皿中，在神经元分化（ND）培养基作用下进一步分化为成熟的神经元（NF200，红色）和胶...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
hiPSC 悬浮胚体培养基：
Knockout DMEM	Thermo-Fisher	10829-018	（步骤 2.1.7）
Knockout 血清替代物（KOSR）	Thermo-Fisher	10828-028	终浓度 20%（步骤 2.1.7）
非必需氨基酸	Thermo-Fisher	11140-035	（步骤 2.1.7）
青霉素/链霉素	Thermo-Fisher	15140-122	终浓度 50 U/mL（步骤 2.1.7）
L-谷氨酰胺 200 mM 溶液	Thermo-Fisher	25030-081	终浓度 2 mM（步骤 2.1.7）
β-巯基乙醇	Thermo-Fisher	31350-010	终浓度 50 µM（步骤 2.1.7）
完全神经上皮诱导培养基（NRI）：
DMEM/F12	Thermo-Fisher	3133-038	（步骤 2.3.1）
非必需氨基酸	Thermo-Fisher	11140-035	（步骤 2.3.1）
N2 添加剂	Thermo-Fisher	17502-048	（步骤 2.3.1）
青霉素/链霉素	Thermo-Fisher	15140-122	终浓度 50 U/mL（步骤 2.3.1）
肝素 I-A 型，≥180 USP 单位/mg	Sigma-Aldrich	H3149-100KU	终浓度 2 µg/mL（步骤 2.3.1）
bFGF	Thermo-Fisher	13256-029	使用前添加，终浓度 20 ng/mL（步骤 2.3.1）
Matrigel 基底膜基质	Corning	354234	1:100（步骤 2.2）。冰上解冻 Matrigel，分装为 200 µL 每管，储存于 -80°C。包被时，将 200 µL 分装液用 20 mL 冷 DMEM/F12 培养基稀释。
层粘连蛋白	Sigma-Aldrich	L2020	1:100（步骤 2.2）。用 1× PBS 稀释。
完全神经元分化培养基（ND）：
Neurobasal 培养基	Thermo-Fisher	21103049	（步骤 2.4.11）
B-27 添加剂（50×）	Thermo-Fisher	17504044	（步骤 2.4.11）
N2 添加剂	Thermo-Fisher	17502-048	（步骤 2.4.11）
青霉素/链霉素	Thermo-Fisher	15140-122	终浓度 50 U/mL（步骤 2.4.11）
GDNF	Thermo-Fisher	PHC7045	终浓度 1 ng/mL，使用前添加。（步骤 2.4.11）
BDNF	Thermo-Fisher	PHC7074	终浓度 2.5 ng/mL，使用前添加。（步骤 2.4.11）