培养和维持小鼠胚胎脑组织来源的多巴胺能神经元

本文内容

摘要

本视频介绍了一种从小鼠胚胎脑组织中培养多巴胺能神经元的方法。该过程包括用蛋白水解酶处理中脑，使细胞解离，并将细胞接种于聚合物包被的盖玻片上，在含抗生素的营养丰富培养基中进行培养，以促进细胞生长并维持其长期存活能力。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 腹侧中脑细胞的解离

在超净工作台中将腹侧中脑组织块转移。吸除Hanks平衡盐溶液（HBSS），向锥形管中加入1 ml预热（37 ºC）的0.05%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（trypsin-EDTA）溶液（体积足以处理最多12块腹侧中脑组织）。将组织在37 ºC孵育5-10分钟。
在超净工作台中吸除trypsin-EDTA溶液，并向组织中加入1 ml去活化培养基（血清可使胰蛋白酶失活）。
吸除去活化培养基，用1 ml完全培养基将组织清洗两次。
注意：为防止丢失解离的细胞，避免将管中所有培养基完全吸除，并避免用移液器直接吹打组织。
加入1 ml完全培养基，使用火焰抛光的玻璃移液管吹打组织。避免产生气泡，持续吹打直至形成单细胞悬液。
注意：通常需要通过受限的移液管尖端吹打8-10次才能实现完全解离。
在室温（RT）下以400 x g离心5分钟，然后吸除上清液。
通过缓慢吹打4次，将沉淀物重悬于1 ml完全培养基中。

2. 接种腹侧中脑细胞

取10 µl细胞悬液与90 µl台盼蓝溶液混合，用血细胞计数板计数细胞数量。
注意： 此时也可检测细胞活力。
将灭菌的微量离心管盖放入100 mm培养皿中，用镊子将预先包被多聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白的盖玻片逐个转移至管盖上方。
注意： 请勿清洗盖玻片，并避免层粘连蛋白干燥，否则可能导致细胞培养不均并降低细胞存活率。
加入完全培养基调节细胞悬液至每1 µl含1,500个细胞，将100 µl细胞悬液（共150,000个细胞）滴加至每张盖玻片上（此体积可充分覆盖盖玻片表面且不会溢出）。盖上培养皿，于湿润的组织培养孵箱中（37 °C，5% CO2）孵育1小时。
注意： 关键步骤：此步骤有助于提高细胞贴壁率和存活率，并增加每个胚胎可获得的盖玻片数量。也可将细胞直接接种至孔板（内含盖玻片）中，但每孔细胞数量需增至350,000个（而非150,000个）。换言之，采用本方法可获得8–10张盖玻片，而直接接种法仅能获得约3–4张，原因是部分细胞会贴附于孔板表面（盖玻片周围或下方）。采用该方法培养的细胞平均存活率约为90%。

3. 培养物的培养与维持

孵育1小时后，小心地将盖玻片连同培养基一起转移至含有400 µl预热至37 ºC的完全培养基的24孔板中（总体积：500 µl）。于37 ºC培养过夜（O/N）。
在孔板孵育后的24小时内，轻柔地向每孔加入500 µl完全培养基。
注意：最初的几个小时是多巴胺能神经元存活最关键的阶段，此后存活细胞数量不再发生显著变化。
在培养的前两周内或直到培养基变黄之前，不要额外添加培养基。若培养超过两周或培养基颜色变为黄色，则更换一半培养基（500 µl）为新鲜的、预热的完全培养基（通常每两周一次）。
注意： 在这些条件下，培养物中的多巴胺能神经元可存活六周以上。

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材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号
DMEM/F12 培养基（Dulbecco 改良 Eagle 培养基与 F-12 营养混合物）	Invitrogen	11330
Hanks' 平衡盐溶液（HBSS）（1×），液体	Invitrogen	24020-117
胎牛血清，热灭活（FBS）	Invitrogen	16140
N2 添加剂（100×），液体	Invitrogen	17502-048
D-(+)-葡萄糖溶液（45%（w/v），溶于水）	Sigma	G8769
牛血清白蛋白 BSA	Sigma	A9430
来源于 Engelbreth-Holm-Swarm 小鼠肉瘤基底膜的层粘连蛋白	Sigma	L2020
青霉素/链霉素	Invitrogen	15070
胰蛋白酶（0.05%（w/v））	Invitrogen	25300
经细胞培养测试的牛血清白蛋白（BSA）	Sigma	A9418
磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma	P3813
多聚-L-鸟氨酸，0.01% 溶液	Sigma	P4957
台盼蓝溶液（0.4%（w/v））	Biowhittaker	17-942E

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