培养和维持小鼠胚胎脑组织来源的多巴胺能神经元

摘要

来源：Weinert, M. 等，从胚胎啮齿类动物脑中分离、培养及长期维持原代中脑多巴胺能神经元的方法。J. Vis. Exp. (2015)

本视频介绍了一种从小鼠胚胎脑组织中培养多巴胺能神经元的方法。该过程包括用蛋白水解酶处理中脑，使细胞解离，并将细胞接种于聚合物包被的盖玻片上，在含抗生素的营养丰富培养基中进行培养，以促进细胞生长并维持其长期存活能力。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 腹侧中脑细胞的解离

1. 在超净工作台中将腹侧中脑组织块转移。吸除Hanks平衡盐溶液（HBSS），向锥形管中加入1 ml预热（37 ºC）的0.05%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（trypsin-EDTA）溶液（体积足以处理最多12块腹侧中脑组织）。将组织在37 ºC孵育5-10分钟。
2. 在超净工作台中吸除trypsin-EDTA溶液，并向组织中加入1 ml去活化培养基（血清可使胰蛋白酶失活）。
3. 吸除去活化培养基，用1 ml完全培养基将组织清洗两次。
   注意：为防止丢失解离的细胞，避免将管中所有培养基完全吸除，并避免用移液器直接吹打组织。
4. 加入1 ml完全培养基，使用火焰抛光的玻璃移液管吹打组织。避免产生气泡，持续吹打直至形成单细胞悬液。
   注意：通常需要通过受限的移液管尖端吹打8-10次才能实现完全解离。
5. 在室温（RT）下以400 x g离心5分钟，然后吸除上清液。
6. 通过缓慢吹打4次，将沉淀物重悬于1 ml完全培养基中。

2. 接种腹侧中脑细胞

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM/F12 培养基（Dulbecco 改良 Eagle 培养基与 F-12 营养混合物）	Invitrogen	11330
Hanks' 平衡盐溶液（HBSS）（1×），液体	Invitrogen	24020-117
胎牛血清，热灭活（FBS）	Invitrogen	16140
N2 添加剂（100×），液体	Invitrogen	17502-048
D-(+)-葡萄糖溶液（45%（w/v），溶于水）	Sigma	G8769
牛血清白蛋白 BSA	Sigma	A9430
来源于 Engelbreth-Holm-Swarm 小鼠肉瘤基底膜的层粘连蛋白	Sigma	L2020
青霉素/链霉素	Invitrogen	15070
胰蛋白酶（0.05%（w/v））	Invitrogen	25300
经细胞培养测试的牛血清白蛋白（BSA）	Sigma	A9418
磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma	P3813
多聚-L-鸟氨酸，0.01% 溶液	Sigma	P4957
台盼蓝溶液（0.4%（w/v））	Biowhittaker	17-942E