分离与培养弥散性内生性脑桥胶质瘤细胞

摘要

来源：Lin, G. L. 等，弥漫性内生型桥脑胶质瘤（DIPG）快速死后细胞培养方案。J. Vis. Exp. (2017)

本视频展示了从弥散性内生型桥脑胶质瘤（DIPG）患者脑干组织中分离和培养胶质前体细胞的过程。从肿瘤组织中分离的胶质细胞 通过 在神经基础培养基中培养经酶消化的细胞，该培养基可促进细胞生长及悬浮神经球的形成。

方案

所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际的人类福利指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查。

1. 获取组织样本

注意：本方案的一个关键步骤是在尸体解剖后立即正确处理组织捐献。样本的整体活性在很大程度上取决于尽量缩短死后间隔时间（Post-Mortem Interval, PMI），立即将组织转移至含有抗生素/抗真菌剂的适当低温保存液中，在运输过程中始终将样本置于湿冰上，并在整个操作过程中保持无菌技术。

1. 接到即将进行捐赠的通知后，准备样本采集包。使用带有隔热容器的运输箱，该容器可直接用于组织样本的返程运输，并包含以下材料：
   1. 准备无菌操作所需材料，包括无菌手套、无菌巾和手术刀。
   2. 在隔热容器中放入8至10个无菌的50 mL锥形管，每管含30 mL运输培养基，并加入冰块或冷袋。
      注意：尽管任何标准细胞培养基均可使用，但使用添加了抗生素/抗真菌剂的Hibernate-A培养基可获得最佳的样本活性。
   3. 根据其他分析需求（例如，固定剂），额外准备相应的样本管。
   4. 若解剖不在研究者所在机构进行，需附上一份明确说明如何采集肿瘤样本的文件。内容应包括保持无菌、将样本管置于湿冰上、以及采集中脑和延髓区域的样本，因为肿瘤细胞常侵入这些区域。
2. 解剖过程中须保持无菌。脑组织在颅骨内被视为无菌，因此一旦打开颅骨，应遵循无菌操作规范（包括更换手套）。避免皮肤和毛发污染至关重要。
3. 从腹侧（脑桥的“腹部”区域，见图1）分离肿瘤。使用无菌手术刀将肿瘤切成约1 cm的小块，立即转移至预冷的运输培养基（参见步骤1.1.2中的注意），并置于湿冰上。每管放入10 mL组织，使每管中组织与培养基的最终总体积为40 mL。
   注意：对于弥漫性内生型脑桥胶质瘤（DIPG），肿瘤会弥漫性浸润脑桥，并常累及脑干其余部分。因此，应尽可能多地采集样本，通常包括来自脑桥的3至4管（30–40 mL组织），以及来自中脑和延髓的各1至2管（每管10–20 mL组织）。
4. 采集与脑桥相邻的中脑和延髓区域的样本，这些区域通常含有大量肿瘤细胞。
5. 样本采集完成后，将样本置于隔热容器中，用湿冰进行隔夜（O/N）运输。严禁使用干冰运输，因为冷冻会导致细胞死亡。

2. 样本处理的准备工作

1. 开始样品制备前，在超紫外（UV）灯下对组织培养罩、剃刀刀片、弯头止血钳及所有其他非无菌工具进行1小时的灭菌处理。后续所有步骤均须在无菌条件下操作，以防止培养物污染。
2. 配制并进行无菌过滤溶液。
   1. 配制1.8 M蔗糖溶液：将308.07 g蔗糖溶解于300 mL蒸馏水中，加入50 mL不含钙和镁的10x Hank's平衡盐溶液（HBSS），再用蒸馏水定容至500 mL。4 °C保存。
   2. 配制酶消化液：每10 mL剪碎的组织，取50 mL含钙和镁的HBSS，加入500 μL 5 mg/mL脱氧核糖核酸酶I（终浓度50 μg/mL）、500 μL 2.5 mg/mL胶原酶I/II与中性蛋白酶混合液（终浓度25 μg/mL）以及500 μL 1 M 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液。将消化液在37 °C水浴中预热。
   3. 配制肿瘤干细胞基础培养基（TSM base）：混合250 mL Neurobasal-A、250 mL Dulbecco改良Eagle培养基：营养混合物F12（DMEM/F12）、5 mL 100x抗生素-抗真菌剂、5 mL 200 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽（GlutaMAX-A）、5 mL HEPES缓冲液、5 mL 100 mM丙酮酸钠以及5 mL 100x MEM必需氨基酸溶液。
   4. 配制含生长因子的完全TSM：向TSM基础培养基中添加以下补充成分：50x B27补充剂（不含维生素A）（1:50稀释）、人表皮生长因子（H-EGF，20 ng/mL）、人成纤维细胞生长因子（H-FGF，20 ng/mL）、人血小板源性生长因子AA（H-PDGF-AA，10 ng/mL）、人血小板源性生长因子BB（H-PDGF-BB，10 ng/mL）以及肝素溶液（2 μg/mL）。
3. 将配备摆动桶转子的实验室离心机预冷至4 °C。

3. 机械解离

1. 将组织转移至一个高壁的 100 mm × 20 mm 细胞培养皿中。去除运输过程中残留的培养基，并加入 10–15 mL 冷培养基替换。
2. 使用弯头止血钳夹住刀片，将组织充分切碎，同时去除明显的血管或脑膜组织。
   注意：最终的组织碎片应小于 1 mm（见图 2B）。
3. 将组织转移至一个洁净的 50 mL 圆锥形离心管中。用额外的 5 mL 冷培养基冲洗细胞培养皿，并将冲洗液转移至离心管中。根据需要重复此洗涤步骤，以转移残留的组织。
4. 使用 10 mL 移液管轻轻吹打 4–5 次。让较大的组织碎片沉降至管底。如有必要，将样品短暂离心 1 分钟（350 × g，4 °C）。
5. 收集机械解离组分。
   1. 将上清液转移，经 100 μm 滤膜过滤至一个新的、标记为“机械解离”的 50 mL 圆锥形离心管中。将滤膜倒置在原始离心管上方，用培养基冲洗以回收残留的组织碎片。
   2. 将“机械解离”组分在 350 × g、4 °C 条件下离心 5 分钟。
   3. 去除“机械解离”组分沉淀中的上清液，并用冷培养基重悬组织。若“机械解离”离心管中的组织体积超过 5 mL，应将组织分装至其他 50 mL 离心管中，确保每管组织体积不超过 5 mL。
6. 将机械解离组分置于冰上保存，直至进行蔗糖梯度离心步骤（第 5 步）。或者，可在酶解解离孵育期间（第 4.4 步）直接将机械解离组分转入第 5 步。

4. 酶解离

1. 如果含有剩余较大组织碎片的离心管中组织体积超过5 mL，则将组织分装至其他新的50 mL锥形管中，确保每管组织体积不超过5 mL。
2. 将含有剩余组织碎片的锥形管在 350 × g、4 °C 条件下离心 5 分钟。
3. 移除上清液，加入预热的酶消化液，每1 mL组织加入5 mL消化液（例如， 5 mL 组织使用 25 mL 消化液。
4. 用实验室封口膜密封锥形管管盖，并在37 °C下于旋转摇床上孵育反应30分钟。
5. 孵育后，轻轻吹打混匀样品（参见 图2C).
   1. 使用10 mL血清移液管将样品上下吹打6至8次。避免产生过多气泡。
   2. 将1,000 μL移液器吸头安装到移液器末端，再吹打6至8次。
   3. 让剩余的组织块沉降到管底。将仍悬浮有细胞的上清液转移并经100 μm滤膜过滤至一个新的已标记为“酶解离”的50 mL锥形管中，置于冰上保存。
   4. 如果仍有显著的组织碎片存在，向碎片中加入额外的10 mL含钙和镁的HBSS，并重复步骤3.5.1和3.5.2。将此最终溶液通过100 μm滤器过滤至“酶解离”管中。
6. 将“酶解离”管在350 × g、4 °C条件下离心5分钟，随后进行蔗糖梯度离心。

5. 蔗糖梯度离心

1. 如果样品仍悬浮于溶液中，以 350 × g 离心 5 分钟（4 °C）。
2. 弃去上清液，将组织重悬于 20 mL 不含钙和镁的冷 HBSS 中，再用冷 HBSS 补充至总体积为 25 mL。
3. 缓慢加入 25 mL 1.8 M 蔗糖溶液，并倒置试管混匀。此操作可形成 0.9 M 蔗糖梯度。
4. 以 800 × g 离心 10 分钟（4 °C），禁止使用离心机刹车。使用刹车会破坏梯度并降低得率（参见 图 2D 以查看离心前后样品的示例）。
5. 小心吸除髓鞘碎片及尽可能多的蔗糖溶液。加入 30 mL 不含钙和镁的冷 HBSS 轻柔混匀以洗涤样品，然后以 350 × g 离心 5 分钟（4 °C）。

6. ACK 红细胞裂解

1. 移除洗涤上清液。加入 5 mL ACK 裂解缓冲液，轻轻重悬细胞沉淀，在室温下轻轻摇动试管 1 分钟。
2. 加入 30 mL 不含钙和镁的冷 HBSS 以终止裂解反应。
3. 在 4 °C 下以 350 × g 离心 5 分钟。

7. 初始培养物的维持

1. 用 10 - 15 mL 含生长因子的预热完全 TSM 重悬最终的细胞沉淀，并使用台盼蓝排斥法在血细胞计数板上定量活细胞密度。
   注意： 活细胞数量因组织捐献的具体情况而异，且由于残留的细胞碎片较多，此早期阶段的定量可能较为困难。理想情况下，每份样本应获得一百万个活细胞。若存在大量残留碎片，则应在 T175 培养瓶中以较低密度接种。
2. 将最终的细胞悬液转移至新的 T75 培养瓶中。每隔一天补充一次额外的生长因子，以维持总体生长因子水平，并监测肿瘤细胞神经球的形成（见 图 2E 和 图 3）。

结果

图1. 脑桥肿瘤的尸检样本。弥漫性内生性脑桥胶质瘤在死亡后立即呈现的外观。该肿瘤表现为位于脑桥腹侧表面的较大、富含髓鞘的肿块。

图 2. 组织样本在不同处理阶段的状态。（A...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Hibernate-A	Gibco	A12475-01
含钙/镁的HBSS	Gibco	24020-117
HBSS	Corning	21-022-CV
HEPES	Gibco	15630-080
Liberase DH（胶原酶/分散酶）	Roche	5401054001
DNA酶I	Worthington Biochemical	LS002007
蔗糖	Sigma	S0389
抗生素/抗真菌剂	Gibco	15240-096
Neurobasal-A	Gibco	10888-022
DMEM/F12	Gibco	11330-032
GlutaMAX-I (100X)	Gibco	35050-061
丙酮酸钠 (100 mM)	Gibco	11360-070
B27补充剂（不含维生素A）	Gibco	12587-010
MEM非必需氨基酸 (100X)	Gibco	11140-050
人PDGF-AA	Shenandoah Biotechnology	100-16
人PDGF-BB	Shenandoah Biotechnology	100-18
人EGF	Shenandoah Biotechnology	100-26
人FGF	Shenandoah Biotechnology	100-146
无菌手术刀片	Bard Paker	372610
弯止血钳	Fine Science Tools	13013-14
剃须刀片	VWR	55411-050
100 × 20 mm细胞培养皿	Corning	353003
无菌镊子	TWD Tradewinds	DF8988-5
无菌手术单	3M	2037
无菌手套	Kimberly Clark	1182307
ACK裂解缓冲液	Gibco	A1049201
100微米筛网滤器	Fisher	352360
50 mL锥形管	Fisher	1495949A