脊髓神经前体细胞向运动神经元的分化

摘要

来源：Taga, A. 等，建立基于区域特异性人多能干细胞来源的星形胶质细胞和神经元模拟肌萎缩侧索硬化症的电生理平台。J. Vis. Exp. (2021)。

本视频展示了一种将脊髓神经前体细胞（NPCs）分化为运动神经元的方法。该方法详细介绍了在包被的培养板上使用特定培养基培养NPCs的过程，该培养基中添加了特定的抑制剂，旨在促进NPCs向成熟运动神经元的分化。

方案

1. 解冻神经前体细胞（NPC）培养物

1. 在解冻细胞的前一天，用多聚鸟氨酸（PLO）和层粘连蛋白包被10 cm培养皿。
   1. 向培养皿中加入5 mL用磷酸盐缓冲液（PBS）或去离子水（dH₂O）稀释至100 µg/mL的PLO溶液。在37 °C下孵育至少1小时，最长可过夜。
   2. 吸除PLO溶液，并用PBS清洗培养皿三次。（若未充分清洗，PLO具有毒性。）
   3. 向已包被PLO的培养皿中加入用PBS稀释至10 µg/mL的层粘连蛋白溶液。在37 °C下孵育至少1小时，建议过夜。孵育后，不进行冲洗，直接吸除层粘连蛋白溶液，以增强细胞贴附。
      注意： PLO包被的培养皿可提前制备，用去离子水清洗三次，在无菌操作台中干燥后，于4 °C保存。
2. 每个10 cm细胞培养皿，解冻一支含有6 x 10⁶ 细胞/支的NPC冻存管。
3. 从液氮中取出NPC冻存管，立即放入37 °C水浴中，最多2分钟。轻轻摇动冻存管，快速融化至仅剩一小块冰晶被液体包围为止。
4. 使用1000 µL移液器将细胞团块转移至15 mL锥形管中，并加入最多15 mL预热的神经分化培养基（NDM）或DMEM/F12培养基（含Ham's F21 F12补充剂），以稀释二甲基亚砜（DMSO）。
5. 以300 x g 离心5分钟。
6. 吸除上清液，用运动神经元（MN）分化培养基（表1）加ROCK抑制剂（20 µM）重悬细胞沉淀，并使用1000 µL移液器反复吹打至获得单细胞悬液（最多5次）。
7. 将单细胞悬液转移至PLO-层粘连蛋白包被的10 cm培养皿中。
8. 将培养皿放入培养箱中，静置过夜，以确保细胞充分贴附。

2. 将脊髓神经前体细胞分化为运动神经元

1. 按照步骤 1.1–1.8 中所述进行初始操作，最终使用含 ROCK-I（20 μM）的运动神经元（MN）分化培养基。
2. 铺板后的第二天，完全更换为不含 ROCK-I 的运动神经元分化培养基，并每隔一天更换一次培养基。周末期间，于周五换液，下周一再换一次。必要时用 PBS 冲洗细胞，以去除细胞碎片。
3. 当胶质定向前体细胞在以细胞簇聚集的终末分裂后运动神经元前体细胞下方以单个增殖性扁平细胞形态出现时，更换为含阿糖胞苷（cytosine arabinoside, ARA-C）（0.02 µM）的运动神经元分化培养基，继续培养 48 小时。
   注意：通常在初次铺板后的前 7 天内发生，但具体时间可能因细胞系不同而有所差异。
4. 48 小时后，吸除含 ARA-C 的培养基，用 PBS 轻柔冲洗培养物三次，然后更换为不含 ARA-C 的新鲜运动神经元分化培养基。
5. ARA-C 处理后，每隔一天（或在周一、周三、周五）更换培养基，使用手动移液器而非真空抽吸装置移除旧培养基，以防止神经元簇过早脱落。此外，每周一次在运动神经元培养基中添加 1 µg/mL 层粘连蛋白（Laminin），以进一步增强神经元在培养板上的贴附。

表1：培养基

培养基名称	试剂	浓度
神经分化培养基 (NDM)	Neurobasal L-谷氨酰胺 非必需氨基酸 添加剂 N - N2 添加剂 青霉素/链霉素	1x 100x 100x 100x 100x
运动神经元分化培养基	神经分化培养基 抗坏血酸 Puromorphamine 脑源性神经营养因子 睫状神经营养因子 胰岛素样生长因子 1 胶质细胞系来源的神经营养因子 视黄酸 Compound E 添加剂 B - B27 添加剂	1x 0.4 µg/mL 1 µM 10 ng/mL 10 ng/mL 10 ng/mL 10 ng/mL 1 μM 125 nM 50x

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 cm 无菌培养皿	Falcon	353003
非必需氨基酸（NEAA）	Thermofisher	11140050	工作浓度 100x
添加剂 N - N2 添加剂	Thermofisher	17502048	工作浓度 100x
L-谷氨酰胺	Thermofisher	25030	工作浓度 100x
Neurobasal 培养基	Thermofisher	21103049	工作浓度 1x
视黄酸（RA）	Sigma	R2625	将 100 mg 溶解于 3.3 mL DMSO 中，配制成 100 mM 储存液。分装为 100 µL/管，于 -80 ºC 冻存。取 200 µL 100 mM 储存液，稀释 10 倍（加入 1.8 mL DMSO）得到 10 mM 储存液。分装为 50 µL/管 ，于 -80 ºC 保存。使用时按 1:10000 稀释（工作浓度 2 µM）。
多聚鸟氨酸（PLO）	Sigma-Aldrich	P3655	将 100 mg 溶解于 1 mL 去离子水中，配制成 100 mg/mL 储存液。分装为 100 µL/管。（工作浓度 100 µg/mL）
层粘连蛋白	Thermofisher	23017-015	储存液浓度 1 mg/mL，工作浓度 10 µg/mL（包被用），1 µg/mL（细胞培养基用）
抗坏血酸（ASAC）	Sigma	A4403	将 100 mg 溶解于 250 mL 去离子水中，配制成 0.4 mg/mL 储存液。经 0.22 µm 滤器无菌过滤后分装，于 -80 ºC 冻存。使用时按 1:1000 稀释（工作浓度 0.4 µg/mL）。
睫状神经营养因子（CNTF）	Peprotech	450-13	将 100 µg 溶解于 1 mL 无菌 PBS 中，再加入 9 mL 无菌 0.1% BSA-PBS，配制成 10 µg/mL 溶液。分装后于 -80 ºC 冻存。使用时按 1:1000 稀释（工作浓度 10 ng/mL）。
Compound E	Abcam	ab142164	将 250 µg 溶解于 2.0387 mL DMSO 中，配制成 250 µM 储存液。分装后于 -80 ºC 冻存。使用时按 1:2000 稀释（工作浓度 125 nM）。
DMEM/F12 培养基	Thermofisher	113300	工作浓度 1x
胶质细胞系来源的神经营养因子（GDNF）	Peprotech	450-10	将 100 µg 溶解于 1 mL PBS 中，配制成 100 µg/mL 溶液，再加入 9 mL 无菌 0.1% BSA-PBS，稀释至 10 µg/mL。分装后于 -80 ºC 冻存。使用时按 1:1000 稀释（工作浓度 10 ng/mL）。
ROCK-I 抑制剂	Peprotech	1293823	将 5 mg 溶解于 1480 µL 去离子水中，配制成 10 mM 储存液，分装后于 -80 ºC 冻存。使用时按 1:500 稀释（工作浓度 20 µM）。
青霉素/链霉素	Thermofisher	15140122	工作浓度 100x
嘌呤霉素（PMN）	Millipore-Sigma	540223	将 5 mg 溶解于 9.6 mL DMSO 中，配制成 1 mM 溶液。分装后于 -80 ºC 冻存。使用时按 1:1000 稀释（工作浓度 1 µM）。
重组人脑源性神经营养因子（BDNF）	Peprotech	450-02	重悬前短暂离心。将 100 µg 溶解于 1 mL PBS 中，配制成 100 µg/mL 溶液，再加入 9 mL 无菌 0.1% BSA-PBS，稀释至 10 µg/mL。分装后于 -80 ºC 冻存。使用时按 1:1000 稀释（工作浓度 10 ng/mL）。
胰岛素样生长因子 1（IGF-1）	R&D systems	291-G1-200	将 200 µg 溶解于 2 mL PBS 中，配制成 100 µg/mL 溶液，再加入 18 mL 0.1% BSA-PBS，稀释至 10 µg/mL 储存液，于 -80 ºC 保存。分装后于 -80 ºC 冻存。使用时将 10 µg/mL 储存液按 1:1000 稀释（工作浓度 10 ng/mL）。
胶质细胞系来源的神经营养因子（GDNF）	Peprotech	450-10	将 100 µg 溶解于 1 mL PBS 中，配制成 100 µg/mL 溶液，再加入 9 mL 无菌 0.1% BSA-PBS，稀释至 10 µg/mL。分装后于 -80 ºC 冻存。使用时按 1:1000 稀释（工作浓度 10 ng/mL）。
视黄酸（RA）	Sigma	R2625	将 100 mg 溶解于 3.3 mL DMSO 中，配制成 100 mM 储存液。分装为 100 µL/管，于 -80 ºC 冻存。取 200 µL 100 mM 储存液，稀释 10 倍（加入 1.8 mL DMSO）得到 10 mM 储存液。分装为 50 µL/管 ，于 -80 ºC 保存。使用时按 1:10000 稀释（工作浓度 2 µM）。
Compound E	Abcam	ab142164	将 250 µg 溶解于 2.0387 mL DMSO 中，配制成 250 µM 储存液。分装后于 -80 ºC 冻存。使用时按 1:2000 稀释（工作浓度 125 nM）。
添加剂 B - B27 添加剂	Thermofisher	21985023	工作浓度 50x
无菌细胞培养罩	Baker Company	SG-600
台式细胞培养离心机	ThermoFisher	75004261	Sorvall Legend X1R
水浴箱	ThermoFisher	2332	Isotemp
湿度可控的细胞培养箱	ThermoFisher	370	设定为 37 ºC，5 % CO2