分离与培养小鼠小脑颗粒神经元前体细胞

摘要

来源：Bovio, P.，等，分离与培养神经前体细胞并进行组蛋白3赖氨酸79二甲基化标记的染色质免疫沉淀。J. Vis. Exp. (2018)

本视频演示了从小鼠幼崽的小脑中分离和培养小脑神经前体细胞的过程。通过差速贴壁法分离并纯化小脑颗粒神经元前体细胞，有效去除星形胶质细胞。这些培养的前体细胞随后可分化为小脑颗粒神经元。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 准备工作

1. CGNP（小脑颗粒神经元前体细胞）分离的准备工作
   1. 安排合适的小鼠交配，以获得用于分离小脑的 P5-P7 阶段动物（每个 ChIP 实验及条件需 3–5 只动物）。
   2. 通过向 HBSS 缓冲液中添加 6 mg/mL 葡萄糖，制备 HBSS/葡萄糖溶液。
   3. 通过向 DMEM-F12 培养基中添加 1 % (v/v) N2 补充剂、1 % (v/v) 青霉素-链霉素-新霉素、25 mM KCl 和 10 % FCS，制备 CGNP 细胞培养基（CGM）。用于 CGNP 培养时，制备不含 FCS 但含有 0.6 µg/mL sonic hedgehog（SHH）的 CGM 培养基（CGM-SHH），并在需要时将其平衡至 37 °C。
   4. 用 100 µg/mL 多聚-D-赖氨酸在室温下包被 6 孔细胞培养板 1–2 小时，用于去除胶质细胞。之后用无菌 ddH₂O 洗涤两次，并让培养板自然干燥。将培养板在 4 °C 下保存，最多保存一周。
   5. 为培养 CGNPs，使用多聚-L-鸟氨酸（0.1 mg/mL）在 4 °C 下过夜包被 6 孔细胞培养板。之后用细胞培养级 H₂O 洗涤两次，并让培养板自然干燥。
      注意： 培养板可在 4 °C 下最多保存一周。
   6. 在 HBSS/葡萄糖溶液中制备 0.025 % (w/v) 胰蛋白酶，并在需要时将其平衡至 37 °C。
2. 脑组织神经前体细胞的分离
   1. CGNPs（小脑颗粒神经元前体细胞）的分离与可选培养
      1. 使用剪刀对 P5–7 阶段动物实施断头处死。去除头皮，打开颅骨，使用小剪刀和镊子取出脑组织。分离小脑并转移至冰上预冷的 HBSS/葡萄糖溶液中。彻底去除所有脑膜和血管，并将小脑转移至装有冷 HBSS/葡萄糖溶液的 15 mL 离心管中。
      2. 用 10 mL 冰上预冷的 HBSS/葡萄糖溶液洗涤小脑三次（每次在 4 °C 下以 650 × g 离心 5 分钟），随后用 1 mL 移液枪轻柔吹打 2–3 次，使组织分散成 0.5–1 mm³ 大小的组织块。
      3. 加入 5 mL 含 0.025 % 胰蛋白酶的 HBSS/葡萄糖溶液，在 37 °C 水浴中持续搅拌孵育 15 分钟。加入 5 mL CGM 培养基终止消化反应，并在 4 °C 下以 650 × g 离心 5 分钟收集组织。
      4. 弃去上清液，用 1 mL CGM 培养基将组织沉淀用 1 mL 移液枪头轻柔吹打重悬，然后转移至新的 15 mL 离心管中。
         注意： 必须避免产生气泡。
         1. 加入 5 mL CGM 培养基，将混合物置于冰上孵育 2 分钟，使未消化的组织碎片沉降。将上清液转移至新的 15 mL 离心管中。向残留组织中加入 2 mL CGM 培养基，重复吹打操作。
      5. 合并所有上清液（不含组织碎片，总体积约 10 mL），在 4 °C 下以 650 × g 离心 5 分钟，收集小脑细胞。将细胞沉淀重悬于 10 mL CGM 培养基中。
      6. 由于星形胶质细胞比 CGNPs 更快且更强地黏附于多聚-D-赖氨酸，因此将细胞接种于经 100 µg/mL 多聚-D-赖氨酸包被的 6 孔板（每孔最多 4 mL），在 37 °C 下孵育 20 分钟以去除星形胶质细胞。
      7. 轻轻摇动培养板并收集上清液，然后在 15 mL 离心管中于 4 °C 下以 650 × g 离心 5 分钟。将细胞沉淀重悬于 10 mL CGM 培养基中，并使用血细胞计数板进行细胞计数。
         注意： CGNPs 呈圆形、体积小，在相差显微镜下观察时可见光环状结构。
      8. 如需培养，将细胞接种于经多聚-L-鸟氨酸包被、已预热至 37 °C 的 CGM 培养基中（每 6 孔板接种 3 × 10⁶ 个细胞），并在 37 °C、5 % CO₂ 和 100 % 相对湿度条件下培养。
         注意： 若将含 FBS 的 CGM 培养基保留在培养板中，将导致 CGNPs 分化为小脑颗粒神经元（CGNs）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
B27 添加剂（50倍浓缩液）	Life Technologies	17504044	类别：细胞培养 缩写/备注：用于 CCM
DMEM-F12	Life Technologies	11320-033	类别：细胞培养 缩写/备注：用于 CGM
胎牛血清 10%（v/v）	Gibco	10082147	类别：细胞培养 缩写/备注：用于 CPC 分离和 CGM
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G5767	类别：细胞培养 缩写/备注：用于 CGNP 分离
谷胱甘肽（1.25 mg/ml）	Sigma-Aldrich	G4251	类别：细胞培养 缩写/备注：用于 CCM
甘氨酸	Carl Roth	3187	类别：ChIP 缩写/备注：用于细胞固定
Hank's 平衡盐溶液	Life Technologies	14025-100	类别：细胞培养 缩写/备注：HBSS
L-谷氨酰胺（200 mM）	Life Technologies	25030081	类别：细胞培养 缩写/备注：用于 CCM
层粘连蛋白	Sigma-Aldrich	L2020	类别：细胞培养 缩写/备注：用于 CPC 培养
N2 添加剂	Life Technologies	17502048	类别：细胞培养 缩写/备注：用于 CGM
Neurobasal 培养基	Gibco	21103049	类别：细胞培养 缩写/备注：用于 CCM
青霉素-链霉素-新霉素 1%（v/v）	Life Technologies	15640055	类别：细胞培养 缩写/备注：PSN，用于 CCM 和 CGM
磷酸盐缓冲液	Life Technologies	10010023	类别：细胞培养 缩写/备注：PBS，用于 CPC 分离
多聚-D-赖氨酸	Sigma-Aldrich	P6407	类别：细胞培养 缩写/备注：用于 CGNP 分离
多聚-L-鸟氨酸氢溴酸盐	Sigma Aldrich	P3655	类别：细胞培养 缩写/备注：用于 CPC 培养
氯化钾	Thermo Fisher	AM9640G	类别：细胞培养 缩写/备注：KCl，用于 CGM
Sonic hedgehog（SHH）	Sigma-Aldrich	SRP6004	类别：细胞培养 缩写/备注：用于 CGNP 分离
超氧化物歧化酶（1 mg/ml）	Sigma-Aldrich	S7571	类别：细胞培养 缩写/备注：用于 CCM
胰蛋白酶-EDTA 0.05%（w/v）	Sigma Aldrich	59417C	类别：细胞培养 缩写/备注：用于 CPC 分离