Isolating and Culturing Murine Cerebellar Granular Neuron Progenitors

doi:10.3791/31075

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Research Article

分离和培养小鼠小脑颗粒神经元祖细胞

July 8, 2025

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Abstract

来源:Bovio， P.， et al.，分离和培养神经祖细胞，然后对组蛋白 3 赖氨酸 79 二甲基化标记进行染色质免疫沉淀。（2018 年）

该视频演示了从小鼠幼崽的小脑中分离和培养小脑神经祖细胞。小脑颗粒神经元祖细胞通过差异粘附被分离和纯化，有效去除星形胶质细胞。这些培养的祖细胞随后分化为小脑颗粒神经元。

Protocol

所有涉及样本采集的程序均已按照研究所的 IRB 指南执行。

1. 准备工作

CGNP（小脑颗粒神经元祖细胞）分离的准备工作
1. 组织适当的小鼠交配以产生 P5-P7 动物以分离小脑（每个 ChIP 和条件 3-5 只动物）。
2. 通过向 HBSS 缓冲液中加入 6 mg/mL 葡萄糖来制备 HBSS/葡萄糖。
3. 通过向 DMEM-F12 中添加 1 % （v/v） N2 补充剂、1 % （v/v）青霉素-链霉素-新霉素、25 mM KCl 和 10 % FCS 来制备 CGNP 细胞培养基（CGM）。对于 CGNP 培养，制备不含 FCS 但包括 0.6 μg/mL 声刺猬（SHH）（CGM-SHH）的 CGM 培养基，并在需要时将其平衡至 37 °C。
4. 在 RT 下用 100 μg/mL 聚-D-赖氨酸包被 6 孔细胞培养板 1-2 小时，以去除神经胶质细胞。然后用无菌 ddH₂O 洗涤两次，让板干燥。将板在 4 °C 下最多储存一周。
5. 对于 CGNP 的培养，在 4 °C 下用聚-L-鸟氨酸（0.1 mg/mL）包被 6 孔细胞培养板过夜。然后，用 H₂O 洗涤两次以进行细胞培养，然后让板干燥。
  注意:板可以在 4 °C 下最多储存一周。
6. 在 HBSS/葡萄糖中制备 0.025% 胰蛋白酶（w/v），并在需要时将其平衡至 37 °C。
脑组织的神经祖细胞分离
1. CGNP（小脑颗粒神经元祖细胞）的分离和可选培养
  1. 使用剪刀斩首对 P5-7 动物实施安乐死。去除头皮皮肤，打开头骨，用小剪刀和镊子去除大脑。分离小脑并将其转移到冰冷的 HBSS/葡萄糖中。去除所有脑膜和血管，将小脑转移到装有冷 HBSS/葡萄糖的 15 mL 试管中。
  2. 用 10 mL 冰冷的 HBSS/葡萄糖洗涤小脑 3 次（通过在 4 °C 下以 650 x g 离心 5 分钟收集它们），然后通过 1 mL 移液管轻轻上下移液（最多 2-3 次）使小脑匀浆，以获得 0.5-1 mm³ 片段。
  3. 加入 5 mL 的 0.025% 胰蛋白酶的 HBSS/葡萄糖溶液，并在 37 °C 水浴中不断搅拌组织孵育 15 分钟。加入 5 mL CGM 终止消化，并在 4 °C 下以 650 x g 离心 5 分钟收集组织。
  4. 取出上清液，用 1 mL 移液管尖端在 1 mL CGM 中研磨组织，然后将其转移到新的 15 mL 试管中><。 注意: 避免气泡很重要。
    1. 加入 5 mL CGM 并在冰上孵育混合物 2 分钟以沉淀组织残留物。将上清液转移到新的 15 mL 试管中。向残留组织中加入 2 mL CGM 并重复研磨程序。
  5. 合并上清液（无组织残留物，总共约 10 mL），并在 4 °C 下以 650 x g 离心 5 分钟以收集小脑细胞。将沉淀重悬于 10 mL CGM 中。
  6. 由于星形胶质细胞比 CGNP 更快、更强地粘附在多聚-D-赖氨酸上，因此将细胞接种在 100 μg/mL 多聚-D-赖氨酸包被的 6 孔板（每孔最多 4 mL）上，并在 37 °C 下孵育 20 分钟以去除星形胶质细胞。
  7. 摇动板并收集上清液。然后在 4 °C 下在 15 mL 试管中以 650 x g 离心 5 分钟。将沉淀重悬于 10 mL CGM 中，并使用 Neubauer 计数室对细胞进行计数。
    注意:CGNP 是圆形的、小的，在使用相差显微镜成像时会显示光晕。
  8. 如果需要，将细胞接种在37°C预热的CGM中，放在聚-L-鸟氨酸包被的板（每6孔3 x 10⁶个细胞）上，并在37°C，5%CO₂ 和100%相对湿度下孵育
    注意:将 CGM 留在板上（以及 FBS）将导致 CGNP 分化为小脑颗粒神经元（CGN）。

Disclosures

No conflicts of interest declared.

Materials

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> B27 添加剂（50x） Life Technologies 公司 17504044 分类: 细胞培养
缩写/注释:用于 CCM DMEM-F12 系列 Life Technologies 公司邮编 11320-033 分类: 细胞培养
缩写/注释:用于 CGM 胎牛血清 10% （v/v）吉布科 10082147 分类: 细胞培养
缩写/注释:For CPC isolation and CGM 葡萄糖西格玛-奥德里奇编号 G5767 分类: 细胞培养
缩写/注释:For CGNP isolation 谷胱甘肽（1.25 mg/ml）西格玛-奥德里奇 G4251 系列分类: 细胞培养
缩写/注释:用于 CCM 甘氨酸卡尔·罗斯 3187 元分类: ChIP
缩写/注释: For cell fixation Hank's 平衡盐溶液 Life Technologies 公司编号 14025-100 分类: 细胞培养
缩写/注释: HBSS L-谷氨酰胺（200 mM） Life Technologies 公司 25030081 分类: 细胞培养
缩写/注释:用于 CCM 层粘连蛋白西格玛-奥德里奇 L2020 年分类: 细胞培养
缩写/注释: For CPC culturing N2 补充剂 Life Technologies 公司 17502048 分类: 细胞培养
缩写/注释:用于 CGM Neurobasal 培养基吉布科 21103049 分类: 细胞培养
缩写/注释:用于 CCM 青霉素-链霉素-新霉素 1% （v/v） Life Technologies 公司 15640055 分类: 细胞培养
缩写/注释:PSN，用于 CCM 和 CGM 磷酸盐缓冲盐水 Life Technologies 公司 10010023 分类: 细胞培养
缩写/注释: PBS， for CPC isolation 聚-D-赖氨酸西格玛-奥德里奇 P6407 分类: 细胞培养
缩写/注释:For CGNP isolation 聚-L-鸟氨酸氢溴酸盐西格玛·奥尔德里奇 P3655 分类: 细胞培养
缩写/注释: For CPC culturing 氯化钾赛默飞世尔 AM9640G 分类: 细胞培养
缩写/注释: KCl，用于 CGM 声速刺猬（SHH）西格玛-奥德里奇 SRP6004 分类: 细胞培养
缩写/注释:For CGNP isolation 超氧化物歧化酶（1mg/ml）西格玛-奥德里奇 S7571 系列分类: 细胞培养
缩写/注释:用于 CCM 胰蛋白酶-EDTA 0.05% （w/v）西格玛·奥尔德里奇 59417C 分类: 细胞培养
缩写/注释:For CPC isolation

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