来源：Shaker, M. R., 等 稳健且高度可重复的皮质脑类器官生成方法用于模拟脑神经元衰老 体外 视频实验杂志 (2022).
本视频展示了将人类多能干细胞（hPSCs）转化为球形脑类器官的过程。通过使用特定的抑制剂，引导hPSCs向神经细胞谱系分化，形成神经外胚层样细胞集落。随后引入特殊的生长因子，促进这些细胞集落的自我组织与增殖，最终形成球形脑类器官。
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方法文章
由人类多能干细胞生成球形体
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
1. 皮质脑类器官的生成（图1）
注意： 本方案的此部分所有步骤均应在 II 级生物安全柜中进行，除非另有说明。
- 从人多能干细胞（hPSCs）二维培养中诱导生成二维神经外胚层集落（第-1至3天）
- 在诱导前，将hPSC集落以20%–30%的密度接种于6孔板中，基质为适用于人胚胎干细胞（hESC）的基底膜基质。可通过将一个6孔板中60%汇合度的hPSC集落传代至三个6孔板孔中来达到该密度。
- 进行基底膜基质包被时，将基底膜基质以1:50的比例用普通基础培养基稀释，每孔加入1 mL，室温（RT）孵育1小时，然后吸除。
- 在开始分化前，使用2 mL无血清细胞培养基将hPSC集落维持培养1天。
- 在hPSC分化当天，使用明场显微镜在4×至10×放大倍数下检查hPSC集落，确保集落状态健康且无明显分化迹象。
注意： 健康的hPSC会形成边界紧密的集落，细胞具有大细胞核、细胞质极少，并有明显的核仁。已分化的iPSC集落在形态上与上述描述的hPSC集落有明显差异，尤其体现在集落外缘或中心区域。 - 添加表1中列出的试剂，配制分化所需的N2培养基。使用前将该培养基恢复至室温（RT）。
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结果
图 1：生成可重复皮质脑类器官的示意图。 从在无饲养层培养基中维持的 hPSCs 生成皮质脑类器官的实验流程示意图。该流程概述了将二维 hPSCs 分化为类器官中三维模式化皮质板人组织所涉及的六个步骤。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 16% 甲醛（W/V），无甲醇 | 赛默飞世尔科技 | 28908 | 4% PFA 用 1x PBS 稀释 |
| 2-巯基乙醇 50 mL（1000倍） | 赛默飞世尔科技澳大利亚公司 (TFS) | 21985023 | 用于NM和DM培养基 |
| B 27 补充剂 10 mL | 赛默飞世尔科技澳大利亚公司（TFS） | 17504044 | 用于NM和DM培养基中 |
| CKX53 显微镜与 SC50 相机 | 奥林巴斯 | ||
| Corning Costar 6 孔细胞培养板 | Sigma Aldrich Pty Ltd | CLS3516-50EA | |
| Dispase II 粉末 | 赛默飞世尔科技 | 17105041 | 粉末溶于HBSS，经0.22 μm滤膜过滤 µm 滤器过滤，分装为 10 mL 份量，于 -20 保存 °C |
| DMEM/F-12 营养混合物 10x 500 mL（DMEM/F-12） | 赛默飞世尔科技 | 11320082 | 用于NM和DM培养基中 |
| DMSO 二甲基亚砜 | Sigma Aldrich Pty Ltd | D2650-100ML | |
| 杜氏磷酸盐缓冲液 | Sigma Aldrich Pty Ltd | D1408-500ML | |
| Falcon Matrigel hESC-合格基质 | In Vitro Technologies Pty Ltd | FAL354277 | 分装成每份100 µL 并在 -20 保存 °C |
| GlutaMAX 补充剂 100x | 赛默飞世尔科技 | 35050061 | 用于NM和DM培养基 |
| Hanks平衡盐溶液 | Sigma Aldrich Pty Ltd | H8264 | |
| 人诱导性多能干细胞（EU79） | 皮肤成纤维细胞体内重编程 | ||
| 人类诱导多能干细胞（G22） | Genea Biocells | 购自 Genea Biocells（美国圣地亚哥） | |
| 人类诱导性多能干细胞（WTC） | Bruce Conklin 教授惠赠 | ||
| InSolution TGF-βΒ RI激酶抑制剂VI，SB431542 | 默克 | US1616464-5MG | |
| 人胰岛素溶液（重组） | Sigma Aldrich Pty Ltd | I9278 | 用于NM和DM培养基 |
| LDN193189 二盐酸盐 | Sigma Aldrich Pty Ltd | SML0559-5MG | 分化过程中使用 |
| MEM非必需氨基酸溶液（100倍浓缩） | 赛默飞世尔科技 | 11140050 | 用于NM和DM培养基 |
| mTeSR Plus | STEMCELL TECHNOLOGIES | 100-0276 | 用于在NM培养基诱导分化前维持hiPSC集落 |
| N2 补充剂 5 mL（100 倍浓缩） | Life Technologies Australia Pty Ltd | 17502048 | 用于NM和DM培养基 |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/mL） | 赛默飞世尔科技 | 15140122 | 用于NM和DM培养基 |
| 重组人碱性成纤维细胞生长因子 | R&D 系统 | 233-FB-01M | 分装成20的等份 µg/mL，并在 -20 保存 °C |
| SB431542 | Tocris | 1614 | 分化过程中使用 |
| 超低吸附多孔板，24孔板，聚苯乙烯 | Sigma Aldrich Pty Ltd | CLS3473-24EA |
