由人类多能干细胞生成球形体

摘要

来源：Shaker, M. R., 等 稳健且高度可重复的皮质脑类器官生成方法用于模拟脑神经元衰老 体外 视频实验杂志 (2022).

本视频展示了将人类多能干细胞（hPSCs）转化为球形脑类器官的过程。通过使用特定的抑制剂，引导hPSCs向神经细胞谱系分化，形成神经外胚层样细胞集落。随后引入特殊的生长因子，促进这些细胞集落的自我组织与增殖，最终形成球形脑类器官。

方案

1. 皮质脑类器官的生成（图1）

注意： 本方案的此部分所有步骤均应在 II 级生物安全柜中进行，除非另有说明。

1. 从人多能干细胞（hPSCs）二维培养中诱导生成二维神经外胚层集落（第-1至3天）
   1. 在诱导前，将hPSC集落以20%–30%的密度接种于6孔板中，基质为适用于人胚胎干细胞（hESC）的基底膜基质。可通过将一个6孔板中60%汇合度的hPSC集落传代至三个6孔板孔中来达到该密度。
   2. 进行基底膜基质包被时，将基底膜基质以1:50的比例用普通基础培养基稀释，每孔加入1 mL，室温（RT）孵育1小时，然后吸除。
   3. 在开始分化前，使用2 mL无血清细胞培养基将hPSC集落维持培养1天。
   4. 在hPSC分化当天，使用明场显微镜在4×至10×放大倍数下检查hPSC集落，确保集落状态健康且无明显分化迹象。
      注意： 健康的hPSC会形成边界紧密的集落，细胞具有大细胞核、细胞质极少，并有明显的核仁。已分化的iPSC集落在形态上与上述描述的hPSC集落有明显差异，尤其体现在集落外缘或中心区域。
   5. 添加表1中列出的试剂，配制分化所需的N2培养基。使用前将该培养基恢复至室温（RT）。
   6. 待培养基恢复至室温后，吸除6孔板各孔中的无血清细胞培养基，并用5 mL移液管轻柔地向每孔加入2 mL N2培养基。
   7. 加入双抑制剂——转化生长因子β激活素受体样激酶抑制剂SB-431542（10 µM）和骨形态发生蛋白抑制剂LDN 193189（100 nM）。
      注意： SMAD抑制剂可在N2培养基加入各孔后添加，也可在更换无血清培养基前加入所需量的N2培养基中。通过轻轻晃动培养板或倒置含有培养基和抑制剂的离心管3–4次，可使抑制剂均匀混入培养基中。
   8. 在接下来的2天内，每天向每孔加入新鲜的N2培养基，并补充SB-431542（10 µM）和LDN 193189（100 nM）。
      注意： 每日更换新鲜N2培养基可减少细胞长期暴露于二甲基亚砜（DMSO）中，DMSO用于溶解SB-431542和LDN 193189化合物，避免其引起的细胞毒性。
2. 从诱导生成的二维神经外胚层集落生成三维神经外胚层球体（第3至7天）
   1. 使用dispase酶按照步骤1.2.2–1.2.8操作，将诱导生成的神经外胚层集落消化脱离。
   2. 首先，从6孔板中移除2 mL N2培养基，并用HBSS洗涤1次，确保完全去除残留的N2培养基。
      注意： N2培养基可能干扰dispase的酶活性，导致神经外胚层集落无法充分脱离孔壁。
   3. 向每个含有集落的孔中加入1 mL浓度为2.4单位/mL的dispase溶液。
   4. 在37 °C下孵育20–25分钟（最长不超过30分钟），定期检查集落脱离情况。
      注意： 较小的集落可能在20分钟内即已脱离。若超过30分钟后仍有集落未脱离，则应放弃这些集落。
   5. 孵育结束后，向孔中加入1 mL N2培养基以终止dispase酶活性，并使用宽口P1000移液枪头或经无菌剪刀剪裁改造的P1000枪头（制成宽口枪头），将集落转移至15 mL离心管中。
   6. 让集落团块依靠重力自然沉降至管底。
      注意： 此过程大约需要1分钟。
   7. 待集落团块沉降后，用标准P1000移液枪头小心吸除上清液，并替换为1 mL新鲜N2培养基。重复此洗涤步骤三次，以确保完全去除残留的dispase。
      注意： 任何残留的dispase都会阻碍神经外胚层球体的均匀形成，并引发细胞死亡。
   8. 洗涤完成后，将细胞团块重悬于3 mL N2培养基中，转移至一个6孔板孔内，并加入40 ng/mL的基础成纤维细胞生长因子（bFGF）。
      注意： 若脱离的神经外胚层集落数量较多，可将其接种于两个或多个6孔板孔中，以防止球体融合。在使用dispase消化脱离集落24小时后，检查是否已形成球体。
   9. 在接下来的3–4天内，继续使用相同培养基维持球体培养，但需每天向每孔补充新鲜bFGF（40 ng/mL），以促进神经外胚层细胞增殖、自组织化，并诱导和扩增神经上皮结构。
      注意： 若球体接种密度较高，培养基可能较快变黄，需每隔2天更换一次并补充新鲜bFGF（40 ng/mL）。但此做法不推荐，建议每孔维持较少数量的球体以避免该问题。若3天后已可见明显的神经上皮结构，可将球体包埋于基底膜基质中；若神经上皮结构不明显或发育较弱，则继续维持培养1天后再行检查。

表1：N2培养基。该表格列出了配制N2培养基所需的试剂。

培养基成分	浓度
DMEM/F-12 营养混合物 F12 10x 500 mL (DMEM/F-12)
N2 补充剂 5 mL (100x)	以 1% 添加
B27 补充剂 10 mL	以 2% 添加
MEM 非必需氨基酸溶液 (100x)	以 1% 添加
青霉素-链霉素 (10,000 U/mL)	以 1% 添加
2-巯基乙醇 50 mL (1000x)	以 0.1% 添加

结果

图 1：生成可重复皮质脑类器官的示意图。 从在无饲养层培养基中维持的 hPSCs 生成皮质脑类器官的实验流程示意图。该流程概述了将二维 hPSCs 分化为类器官中三维模式化皮质板人组织所涉及的六个步骤。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
16% 甲醛（W/V），无甲醇	赛默飞世尔科技	28908	4% PFA 用 1x PBS 稀释
2-巯基乙醇 50 mL（1000倍）	赛默飞世尔科技澳大利亚公司 (TFS)	21985023	用于NM和DM培养基
B 27 补充剂 10 mL	赛默飞世尔科技澳大利亚公司（TFS）	17504044	用于NM和DM培养基中
CKX53 显微镜与 SC50 相机	奥林巴斯
Corning Costar 6 孔细胞培养板	Sigma Aldrich Pty Ltd	CLS3516-50EA
Dispase II 粉末	赛默飞世尔科技	17105041	粉末溶于HBSS，经0.22 μm滤膜过滤 µm 滤器过滤，分装为 10 mL 份量，于 -20 保存 °C
DMEM/F-12 营养混合物 10x 500 mL（DMEM/F-12）	赛默飞世尔科技	11320082	用于NM和DM培养基中
DMSO 二甲基亚砜	Sigma Aldrich Pty Ltd	D2650-100ML
杜氏磷酸盐缓冲液	Sigma Aldrich Pty Ltd	D1408-500ML
Falcon Matrigel hESC-合格基质	In Vitro Technologies Pty Ltd	FAL354277	分装成每份100 µL 并在 -20 保存 °C
GlutaMAX 补充剂 100x	赛默飞世尔科技	35050061	用于NM和DM培养基
Hanks平衡盐溶液	Sigma Aldrich Pty Ltd	H8264
人诱导性多能干细胞（EU79）			皮肤成纤维细胞体内重编程
人类诱导多能干细胞（G22）	Genea Biocells		购自 Genea Biocells（美国圣地亚哥）
人类诱导性多能干细胞（WTC）			Bruce Conklin 教授惠赠
InSolution TGF-βΒ RI激酶抑制剂VI，SB431542	默克	US1616464-5MG
人胰岛素溶液（重组）	Sigma Aldrich Pty Ltd	I9278	用于NM和DM培养基
LDN193189 二盐酸盐	Sigma Aldrich Pty Ltd	SML0559-5MG	分化过程中使用
MEM非必需氨基酸溶液（100倍浓缩）	赛默飞世尔科技	11140050	用于NM和DM培养基
mTeSR Plus	STEMCELL TECHNOLOGIES	100-0276	用于在NM培养基诱导分化前维持hiPSC集落
N2 补充剂 5 mL（100 倍浓缩）	Life Technologies Australia Pty Ltd	17502048	用于NM和DM培养基
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）	赛默飞世尔科技	15140122	用于NM和DM培养基
重组人碱性成纤维细胞生长因子	R&D 系统	233-FB-01M	分装成20的等份 µg/mL，并在 -20 保存 °C
SB431542	Tocris	1614	分化过程中使用
超低吸附多孔板，24孔板，聚苯乙烯	Sigma Aldrich Pty Ltd	CLS3473-24EA