使用微流控共培养系统分析牙胚和三叉神经节的相互作用

摘要

来源:Pagella， P. 等人。使用微流控共培养装置发育齿胚神经支配的分析。J. Vis. Exp.（2015 年）。

该视频演示了利用微流体设备研究牙胚芽牙髓和三叉神经节之间的相互作用。它展示了组织在微流体装置内的位置，并提供了通过装置的微槽向牙胚生长的三叉神经突的详细可视化。此外，它强调了牙齿来源的分子因子在促进或抑制神经突延伸到牙胚芽牙髓中的作用，这对于确保有效的出生后牙齿神经支配至关重要。

方案

所有涉及样本采集的程序均已按照研究所的 IRB 指南执行。

1. 解剖材料、培养基、微流控装置的制备

1. 高压灭菌显微解剖镊子和剪刀（121°C，灭菌时间:20分钟）并将它们储存在无菌容器中。
2. 通过在 37 °C 的轨道振荡器上将玻璃盖玻片 （24 mm x 24 mm） 在 1 M HCl 中孵育 24 小时，对玻璃盖玻片 （24 mm x 24 mm） 进行消毒。用无菌蒸馏 H₂O 洗涤三次，用 99% 乙醇洗涤三次。然后在 37 °C 或无菌流动罩下干燥盖玻片。最后，高压灭菌或将盖玻片暴露在紫外线下（30 分钟）以完成灭菌。然后可以将盖玻片储存在 70% 的乙醇中。
3. 使用无菌镊子，小心地从包装中取出 AXIS 轴突分离设备，并将其放入无菌培养皿中。
4. 使用无菌活检打孔器 （ø: 1mm） 为每个要培养的样品创建一个孔（图 1），与培养室相对应><。 注意: 不要冲孔太靠近微槽，因为它们可能会因施加的压力而损坏。
5. 通过将 AXIS 轴突分离装置浸入 70% 的乙醇中对其进行消毒。然后在无菌流通罩下完全干燥 AXIS 轴突分离装置和盖玻片。请至少等待 3 小时，然后再继续。
   注意: 不完全干燥将导致微流体装置的组装有缺陷。
6. 将每个盖玻片放入 35 mm 培养皿或 6 孔板内的孔中。
7. 将 AXIS 轴突隔离装置放在盖玻片上，用弯曲端的镊子轻轻但用力按压，以使隔离装置和玻璃盖玻片之间完全粘附。
8. 在每个培养室中，移液 150 μl 聚-D-赖氨酸（无菌，蒸馏 H₂O 中为 0.1 mg/ml）。将微流体装置在真空下 5 分钟，以去除培养室中的所有空气。
9. 如果腔室内仍可见空气，请将聚-D-赖氨酸溶液重新移液到腔室中。
10. 将装置与聚-D-赖氨酸O / N在37°C下孵育。
11. 用无菌蒸馏 H₂O 洗涤腔室 3 次。
12. 用 150 μl 层粘连蛋白工作溶液（Sigma-Aldrich，5 μg/ml，在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 或无血清培养基中）填充腔室，并在 37 °C 下孵育 O/N。
13. 准备 50 ml 用于三叉神经节培养的培养基，其成分如下:48 ml Neurobasal 培养基、1 ml B-27、100 U/ml 青霉素/链霉素、2 mM L-谷氨酰胺、5 ng/ml 神经生长因子 （NGF）、0.25 pM 胞嘧啶阿拉伯糖苷。
14. 准备 50 ml 用于牙齿胚芽培养的培养基，其成分如下:40 ml Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM）-F12,10 ml 胎牛血清（FBS，终浓度:20%），100 U/ml 青霉素/链霉素，2 mM L-谷氨酰胺，150 μg/ml 抗坏血酸。

2. 小鼠胚胎的产生和解剖

1. 根据阴道栓确定胚胎年龄（阴道栓:胚胎发育日 0.5、E0.5）并通过形态学标准确认。 对于该方案，我们通常使用 E14.5-E17.5 小鼠胚胎。
2. 用 70% 乙醇清洁解剖区域和立体镜。
3. 通过宫颈脱位牺牲怀孕的母亲。将鼠标的脖子放在网格上的第一根和第二根手指之间，然后果断地拉动尾巴。
4. 解剖下腹部周围的皮肤，用剪刀打开腹部。定位子宫:在怀孕后期，子宫大量充满腹腔。
5. 解剖子宫并将其放入装满 PBS 的冰管中。在冰上时，组织可以放置数小时。根据机构指南丢弃母亲的尸体。
6. 从子宫中解剖胚胎，并将其从胚外组织中释放出来。将胚胎置于冰上的 PBS 中。
7. 用剪刀将胚胎斩首，并使用显微解剖剪刀将下颌与头部的其余部分分开（图 2A）。精确切除下颌，不损伤三叉神经节;由于后者位于下颌附近，因此可能会造成意外损伤。将下颌和头部的其余部分保存在冰上的冷 PBS 中。
8. 要解剖三叉神经节 （TG），取头部并将其放在先前装满冷 PBS 的解剖玻璃培养皿上。使用镊子去除皮肤和头骨。然后将镊子放在端脑下方并提起，去除端脑和小脑;端脑和小脑会一起翻转，使颅底暴露在外。
9. 定位三叉神经节（图 2B）。使用镊子将 TG 与三叉神经分离。使用解剖针作为刀消除三叉神经突起的残留物。将解剖的 TG 放入装满冷 PBS 的培养皿中，并保持在冰上。
10. 要解剖胚胎牙齿，请将先前与颅骨分离的下颌放在装满冷 PBS 的解剖玻璃培养皿上。使用解剖针作为刀，去除舌头和下巴周围的皮肤。沿下颌中线切割，将左半颌和右半颌分开。牙齿细菌很容易看到，如图 2C 所示。使用解剖针分离牙菌并去除多余的非牙齿组织。将解剖的牙胚放入装满冷 PBS 的培养皿中，并保存在冰上。

3. 微流控共培养

1. 解剖后，从微流体装置中取出层粘连蛋白。用 200 μl 相应的培养基填充腔室。
2. 用镊子轻轻地将解剖的 TG 和牙齿细菌转移到穿孔产生的孔中（图 2D）。确保牙菌不会漂浮，并且它们会下沉，直到接触盖玻片。
3. 将样品在 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中培养。
4. 每 48 小时更换一次培养基。不要完全清空腔室，也不要直接移液到培养室中。
   腔室完全排空会导致腔室内形成气泡;直接移液到腔室会导致轴突损伤。为避免这些问题，请去除将移液器指向孔外侧的培养基;同样，移液位于腔室对面的孔一侧的新鲜培养基。
5. 在培养期间，共培养物可以很容易地通过延时显微镜成像，并且可以维持 10 天以上。
6. 培养期后，将 150 μl PBS 移液到每个腔室的一个孔中，让 PBS 流过腔室 3 次，从而清洗腔室。
7. 取出 PBS 并通过在每个腔室的一个孔中吸取 150 μl 4% 多聚甲醛（在 PBS 中）来固定样品;在 RT 下孵育 15 分钟。如 3.6 中所述，用 PBS 洗涤腔室两次。
8. 继续进行进一步分析。

结果

图 1. 从上方看到已安装的微流体共培养装置 （A）;（B） 部分外侧。培养室 （cc） 以红色 （yosin） 和蓝色 （甲苯胺蓝） 突出显示;微槽 （MG） 可以看作是培养室之间的白线。神经节和共培养的器官/组织通过装置上的打孔 （ph） 放入适当的培养室中。通过孔 （mw） 添加和去除培养基。

图 2.（A） 小鼠胚胎头部的侧视图（胚胎发育日 E14.5）。黑线表示应该切开下颌的位置，以保持三叉神经节和牙胚的完整...

材料