使用微流控共培养系统分析牙胚与三叉神经节的相互作用

摘要

来源：Pagella, P.，等。利用微流控共培养装置分析发育中牙胚的神经支配。 J. Vis. Exp. (2015)。

本视频展示了利用微流控装置研究牙胚牙髓与三叉神经节之间相互作用的方法。视频中演示了将组织放置于微流控装置内的操作过程，并详细呈现了三叉神经突通过装置中的微通道向牙胚生长的可视化过程。此外，视频还强调了牙源性分子因子在促进或抑制神经突延伸进入牙胚牙髓中的作用，这对于确保出生后牙齿有效神经支配至关重要。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 解剖材料、培养基和微流控装置的准备

1. 将显微解剖镊子和剪刀进行高压灭菌（121 °C，灭菌时间：20 分钟），并存放于无菌容器中。
2. 将玻璃盖玻片（24 mm × 24 mm）置于 1 M HCl 中，在 37 °C 摇床上孵育 24 小时进行灭菌。用无菌蒸馏 H₂O 洗涤三次，再用 99% 乙醇洗涤三次。随后在 37 °C 下干燥或在无菌超净台中干燥。最后，通过高压灭菌或紫外线照射（30 分钟）完成灭菌。盖玻片可随后保存在 70% 乙醇中。
3. 使用无菌镊子小心地从包装中取出 AXIS 轴突分离装置，并将其放入无菌培养皿中。
4. 使用无菌活检打孔器（ø：1 mm），在每个待培养样品的培养室对应位置打一个孔（图 1）。
   注意：打孔时切勿过于靠近微通道，以免施加的压力损坏微通道结构。
5. 通过将 AXIS 轴突分离装置浸入 70% 乙醇中进行灭菌。然后在无菌超净台中将 AXIS 轴突分离装置和盖玻片彻底干燥。至少等待 3 小时后再进行后续操作。
   注意：干燥不完全会导致微流控装置组装失败。
6. 将每片盖玻片放入一个 35 mm 培养皿或 6 孔板中的孔内。
7. 将 AXIS 轴突分离装置放置在盖玻片上，并使用末端弯曲的镊子轻轻但牢固地按压，以确保分离装置与玻璃盖玻片之间完全贴合。
8. 在每个培养室中加入 150 μl 多聚-D-赖氨酸溶液（0.1 mg/ml，溶于无菌蒸馏 H₂O）。将微流控装置置于真空环境中 5 分钟，以去除培养室中的所有空气。
9. 若培养室中仍可见气泡，需重新向其中加入多聚-D-赖氨酸溶液。
10. 将装置在 37 °C 条件下与多聚-D-赖氨酸共同孵育过夜（O/N）。
11. 用无菌蒸馏 H₂O 洗涤培养室三次。
12. 向培养室中加入 150 μl 层粘连蛋白工作液（Sigma-Aldrich，5 μg/ml，溶于磷酸盐缓冲液（PBS）或无血清培养基），并在 37 °C 条件下孵育过夜（O/N）。
13. 配制 50 ml 三叉神经节培养用培养基，组成为：48 ml Neurobasal 培养基、1 ml B-27 添加剂、100 U/ml 青霉素/链霉素、2 mM L-谷氨酰胺、5 ng/ml 神经生长因子（NGF）、0.25 pM 阿糖胞苷。
14. 配制 50 ml 牙胚培养用培养基，组成为：40 ml DMEM-F12 培养基、10 ml 胎牛血清（FBS，终浓度：20%）、100 U/ml 青霉素/链霉素、2 mM L-谷氨酰胺、150 μg/ml 抗坏血酸。

2. 小鼠胚胎的制备与解剖

1. 根据阴道栓（阴道栓：胚胎发育0.5天，E0.5）确定胚胎年龄，并予以确认 通过 形态学标准。本方案通常使用 E14.5-E17.5 天的小鼠胚胎。
2. 用70%乙醇清洁解剖区域和体视显微镜。
3. 通过颈椎脱位法处死怀孕母鼠。将小鼠颈部置于网格上第一和第二手指之间，果断牵拉尾部。
4. 解剖下腹部周围的皮肤，并用剪刀打开腹腔。找到子宫：在妊娠晚期，子宫会大量充盈腹腔。
5. 取出子宫并置于盛有PBS并置于冰上的试管中。组织在冰上可保存数小时。根据机构指南处理母体尸体。
6. 从子宫中分离胚胎，并去除其胚外组织。将胚胎置于冰上的磷酸盐缓冲液（PBS）中。
7. 使用剪刀将胚胎去头，再用显微解剖剪将下颌与头部其余部分分离（图2A). 精细地移除下颌，避免损伤三叉神经节；由于三叉神经节紧邻下颌，操作中可能意外损伤。将下颌及头部其余部分保存于冰上预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）中。
8. 为分离三叉神经节（TG），取头部置于已盛有冷PBS的解剖用玻璃培养皿中。用镊子去除皮肤和颅骨，随后将镊子置于端脑下方并上提，使端脑与小脑一同翻起，从而暴露颅底。
9. 定位三叉神经节（图2B）。用镊子将三叉神经节（TG）从三叉神经上分离。使用解剖针作为刀具，去除三叉神经的残留投射纤维。将分离出的TG置于盛有冷PBS的培养皿中，并置于冰上保存。
10. 为了分离胚胎牙齿，将先前从颅骨上取下的下颌置于装有冷PBS的解剖玻璃培养皿中。使用解剖针作为刀具，去除舌头及下颌周围的皮肤。沿下颌中线切割，分离左侧与右侧半下颌。牙胚清晰可见，如图所示 图2C用解剖针分离牙胚，并去除多余的非牙体组织。将分离好的牙胚置于盛有冷 PBS 的培养皿中，并置于冰上保存。

3. 微流控共培养

1. 解剖后，从微流控装置中去除层粘连蛋白。用200 μl相应的培养基填充各腔室。
2. 用镊子将解剖得到的三叉神经节（TG）和牙胚轻轻转移至打孔所形成的孔洞中（图2D）。确保牙胚不会漂浮，并沉降至与盖玻片接触。
3. 将样品在37 °C、5% CO₂的培养箱中进行培养。
4. 每48小时更换一次培养基。不要将腔室完全排空，也不要直接将移液管插入培养腔室。
   完全排空腔室会导致腔室内形成气泡；直接向腔室中移液可能导致轴突损伤。为避免上述问题，移除培养基时应将移液管尖端指向孔板外侧；同样，添加新鲜培养基时应将其加至与腔室相对的孔板另一侧。
5. 在培养期间，可通过延时显微成像轻松观察共培养样品，且样品可维持培养超过10天。
6. 培养结束后，通过向每个腔室的一个孔中加入150 μl PBS并使其流经腔室三次，清洗腔室。
7. 吸除PBS，向每个腔室的一个孔中加入150 μl 4%多聚甲醛（溶于PBS中）固定样品；室温孵育15分钟。按步骤3.6所述方法用PBS清洗腔室两次。
8. 继续进行后续分析。

结果

图 1. 微流控共培养装置的安装视图：（A）俯视图；（B）部分侧视图。培养室（cc）分别用红色（伊红）和蓝色（甲苯胺蓝）标出；微沟道（mg）在培养室之间呈现为一条白线。神经节及共培养的器官/组织通过装置上的穿孔（ph）放入相应的培养室中。培养基通过加样孔（mw）添加和移除。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AXIS 轴突分离装置	Millipore	AX15010-TC	提供不同长度的微通道
层粘连蛋白	Sigma Aldrich	L2020
Neurobasal 培养基	Gibco	21103-049
B27 补充剂	Gibco	17504
重组小鼠 β-NGF	R&D Systems	1156-NG-100	人和大鼠 β-NGF（R&D Systems）具有等效性
DMEM-F12 培养基	Gibco	11320-033