使用隔室化微流控装置将神经干细胞分化为神经元

摘要

来源：Paranjape, S. R. 等人，et al. 人干细胞来源神经元在预组装塑料微流控芯片内的区室化培养，J. Vis. Exp. (2019)

该视频展示了利用微流控装置对神经干细胞（NSCs）进行分化的过程，该装置包含由微沟屏障分隔的胞体区和轴突区。将神经干细胞引入胞体区并使其贴壁。神经干细胞在胞体区内分化为神经元，并通过微沟屏障将轴突延伸至轴突区。

方案

注意： 图1A、B 展示了预组装的环烯烃共聚物（COC）芯片的示意图，包括主通道或腔室、孔、微沟槽的位置。这种分室芯片可在各腔室内建立独立的流体微环境，如食用染料的隔离所示（图1C）。

1. 用于人源干细胞神经元的多区室芯片包被

注意： 图2A 展示了包被步骤的总体流程。

1. 将聚-L-鸟氨酸溶解于细胞培养级蒸馏水中，配制每片芯片 600 µL 的 20 µg/mL 工作液。
2. 吸除芯片制备后残留在孔中的磷酸盐缓冲液（PBS）。吸液时，确保移液器吸头远离通道开口。
   注意： 微流控通道在整个操作过程中必须始终保持充满液体状态。仅可吸除孔中的液体，不得从通道/腔室中吸液。
3. 向右上孔中加入 150 µL 聚-L-鸟氨酸工作液。等待 90 秒，或直至液体开始流入右下孔。向右下孔中加入 150 µL 培养基，静置 5 分钟，使液体通过微沟槽。
4. 向左上孔中加入 150 µL 培养基。等待 90 秒后，向左下孔中加入 150 µL 培养基。用封口膜包裹芯片支架，并于 4 °C 过夜放置。
   注意： 也可将芯片及其支架置于 37 °C 环境中 1 小时。
5. 从孔中吸除培养基，确保移液器吸头远离通道开口。向右上孔中加入 150 µL 无菌水。等待 90 秒后，向右下孔中加入 150 µL 无菌水。静置 5 分钟，使液体通过微沟槽。
6. 向左上孔中加入 150 µL 无菌水，等待 90 秒后，再向左下孔中加入 150 µL 无菌水。
7. 重复步骤 1.5–1.6。
8. 将层粘连蛋白在 2 °C 至 8 °C 条件下缓慢解冻，并配制 10 µg/mL 的工作液。
9. 向右上孔中加入 150 µL 层粘连蛋白工作液。等待 90 秒，或直至液体开始流入右下孔。向右下孔中移取 150 µL 层粘连蛋白溶液。静置 5 分钟，使层粘连蛋白通过微沟槽。
10. 向左上孔中加入 150 µL 层粘连蛋白溶液。等待 90 秒后，向左下孔中加入 150 µL 层粘连蛋白溶液。将芯片置于其支架中，在 37 °C 下孵育 2 小时。
11. 用不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 PBS 冲洗芯片。向右上孔中加入 150 µL PBS。等待 90 秒，或直至液体开始流入右下孔。向右下孔中加入 150 µL PBS，静置 5 分钟，使 PBS 通过微沟槽。
12. 向左上孔中移取 150 µL PBS。90 秒后，向左下孔中移取 150 µL PBS。
13. 从芯片中吸除 PBS，然后用 NSC 培养基冲洗芯片（参见 材料表）。向右上孔中加入 150 µL 培养基。90 秒后，或当液体通过右侧通道进入右下孔时，向右下孔中加入 150 µL 培养基。静置 5 分钟，使培养基流经微沟槽。
14. 向左上孔中加入 150 µL 培养基，再向左下孔中加入 150 µL 培养基。将芯片置于 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中孵育，以预处理芯片，直至准备接种 NSC。
    注意： 如有需要，芯片可预处理过夜。

2. 将神经干细胞接种到多区室芯片中

注意：本实验方案使用 commercially purchased NSCs（商业购买的神经干细胞），不同于我们之前发表的研究，后者起始于人胚胎干细胞。在本方案中，神经干细胞直接接种到塑料芯片中，并在其中分化为神经元。这些细胞可作为神经干细胞（不进行分化）扩增培养至多2代，并可分装保存于液氮（liquid N₂）中以备后续使用。本方案所用的神经干细胞为第1代或第2代后保存于液氮（liquid N₂）中的冻存细胞。图2B展示了包被操作的总体流程。

1. 根据制造商的说明解冻神经干细胞（NSCs）。
   注意：本操作步骤适用于H9来源的神经干细胞。其他细胞系需要优化细胞密度。
2. 使用血细胞计数板测定细胞浓度，并用NSC培养基调整至每毫升含7 × 10⁶个细胞。
3. 从芯片的每个孔中吸除培养基。注意避免吸除主通道中的培养基。
4. 将5 µL细胞悬液加入右上方孔中，随后将5 µL加入右下方孔中（总计70,000个细胞）。确保将细胞悬液滴加至主通道开口附近。使用显微镜检查细胞是否已进入通道。静置5分钟，使细胞贴附于芯片底部。
   注意：可使用一个或两个腔室进行细胞接种。
5. 向右上方孔加入约150 µL NSC培养基，然后向右下方孔加入150 µL。左侧操作同上。将芯片置于合适的加湿容器中，在5% CO₂、37 °C条件下孵育。
6. 48小时后，吸除各孔中的NSC培养基，并向每个上孔和下孔分别加入150 µL神经分化培养基进行替换。
7. 将神经元置于合适的加湿容器中，在5% CO₂、37 °C的培养箱中继续培养。

结果

图1：预组装的环烯烃共聚物（COC）多区室微流控芯片。（A）芯片示意图，标明上部和下部小室。芯片尺寸为75 mm × 25 mm，与标准显微镜载玻片尺寸相同。（B）局部放大图，显示分隔通道的微通道和微沟槽结构。（C）本照片通过食用色素染料展示了利用该芯片在每个区室内建立独立微环境的过程。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
完全神经干细胞培养基：
REC HU EGF 10 UG BIOSOURCE (TM)	ThermoFisher Scientific	PHG0314	20ng/mL
REC HU FGF BASIC 10 UG BIOSOURCE (TM)	ThermoFisher Scientific	PHG0024	20ng/mL
GlutaMAX 补充剂 (100X)	ThermoFisher Scientific	35050061	2mM
KnockOut DMEM/F-12	ThermoFisher Scientific	12660012
StemPro 神经补充剂	ThermoFisher Scientific	A1050801	2%
不含钙和镁的 Gibco DPBS	ThermoFisher Scientific	14190144
GIBCO 人神经干细胞 (H9) 套件组合试剂盒	Gibco	N7800200
Gibco 层粘连蛋白	ThermoFisher Scientific	23017015
玻璃巴斯德吸管	Sigma-Aldrich	CLS7095D5X SIGMA	长度 5.75 英寸
H9 来源的人神经干细胞 每管 1×10⁶ 个细胞；1 mL	ThermoFisher Scientific	510088
hibernate-E 培养基	ThermoFisher Scientific	A1247601
培养箱，5% CO2，37 °C
Mr. Frosty	ThermoFisher Scientific	5100-0001
神经分化培养基			每 100 mL
抗生素-抗真菌剂 (100x)	ThermoFisher Scientific	15240112	1mL (100X)
抗坏血酸	Sigma Aldrich	A8960	200mM
BDNF	ThermoFisher Scientific	PHC7074	40 ng/mL
Gibco B27 Plus 补充剂 (50X)	FisherScientific	A3582801	2mL (50X)
Gibco CultureOne 补充剂 (100X)	FisherScientific	A3320201	1mL (100X)
Gibco Neurobasal Plus 培养基	FisherScientific	A3582901
StemPro Accutase 细胞解离试剂	ThermoFisher Scientific	A1110501
XC 预包被液	Xona Microfluidics, LLC	XC Pre-Coat	随 XonaChips 提供
XonaChip	Xona Microfluidics, LLC	XC450	450 µm 长微沟槽屏障
加湿托盘	Xona Microfluidics, LLC	humidifier tray