从小鼠出生后小脑中分离干细胞并诱导其分化为神经细胞

摘要

来源：Edamakanti, C. R., 等 从出生后小鼠小脑中纯化Prominin-1⁺干细胞。J. Vis. Exp. (2020)。

本视频展示了一种从出生后小鼠小脑中分离干细胞并将其分化为神经细胞的方法。利用抗体包被的磁珠从分离的细胞悬液中纯化干细胞，并进行培养以形成神经球。随后将神经球维持在分化培养基中，以诱导生成神经细胞。

方案

1. 溶液的配制

1. 制备组织解离液：使用含酚红的无菌杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS），并加入木瓜蛋白酶（100 U/mL）、半胱氨酸（0.2 mg/mL）和脱氧核糖核酸酶（DNase，250 U/mL）。
2. 配制DNase溶液：将一瓶冻干粉末DNase I（100 mg）溶于50 mL H₂O中，充分混匀后过滤，得到母液。将母液分装为每管10 mL的储存液，再将其中一管进一步分装为每管0.5 mL的单次使用 aliquot。单次使用分装液储存于-80 °C。
3. 通过配制磁性分离柱缓冲液X来准备磁性分离试剂：含0.5%牛血清白蛋白（BSA）和2 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的溶液。
4. 配制神经球培养基：使用含青霉素/链霉素和L-谷氨酰胺的Neurobasal培养基，并添加2% B27、20 ng/mL人重组表皮生长因子（EGF）和20 ng/mL人重组碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）。
5. 配制分化培养基：使用Neurobasal培养基，并添加10 ng/mL分化因子血小板源性生长因子（PDGF-AA）或10 ng/mL白血病抑制因子（LIF），以及2% B27。
6. 使用超低吸附性的12孔（3.5 cm²）和6孔（9.6 cm²）培养板。

2. 小脑解剖

1. 用异氟烷麻醉小鼠幼崽（P3-P7），并用手术剪断头。
2. 用70%乙醇喷洒分离的幼鼠头部。
3. 将每只幼鼠的头部转移至一个无菌的10 cm空培养皿中。使用显微解剖剪剥离皮肤，然后沿中线矢状方向剪开颅骨以去除颅骨。
4. 使用#7镊子从脑干尾侧开始剥离颅骨骨片。用刮勺小心抬起脑组织，保持小脑完整，将脑转移至含15 mL冰浴Hanks平衡盐溶液（HBSS）的新鲜无菌10.0 cm培养皿中。
5. 将盛有脑组织的培养皿置于解剖显微镜下。使用精细的#5镊子去除小脑的脑膜和大血管，并用刮勺将小脑与脑干分离。
6. 将小脑转移至含有5.0 mL冰浴HBSS溶液的15 mL离心管中。用5.0 mL HBSS洗涤小脑，倾倒洗涤液，重复洗涤3次。
   注意：每个小脑应单独置于一个离心管中以进行后续处理。

3. 细胞悬液制备

1. 将含有脑组织的培养皿置于解剖显微镜下。使用精细的#5镊子去除小脑的脑膜和大血管，并用解剖刀将小脑与脑干分离。
2. 将小脑转移至含有5.0 mL冰浴HBSS溶液的15 mL离心管中。用5.0 mL HBSS溶液冲洗并倾倒，重复洗涤3次。
   注意：每个小脑应单独放入一个离心管中以进行后续处理。
3. 最后一次冲洗后，加入5 mL已预热至37 °C的木瓜蛋白酶组织解离溶液。将组织在37 °C水浴中孵育15分钟。每隔3分钟，通过手动或使用旋转混合器将离心管上下颠倒3–5次，缓慢混匀管内内容物。
4. 按照前述方法准备一支大口径（普通玻璃移液管）和一支细口径巴斯德移液管（在本生灯上加热后火焰抛光）。
5. 用5 mL HBSS溶液洗涤组织3次，在手动倾倒时注意避免组织丢失。
6. 去除最后一次HBSS洗涤液，向组织中加入5 mL含有250 μL DNase溶液的DPBS溶液。使用大口径巴斯德移液管吹打10–15次以解离组织。此步骤应轻柔操作，避免产生气泡。
7. 随后将悬液在37 °C水浴中继续孵育10分钟，通过反复倒置和扶正离心管进行混匀。
8. 使用细口径巴斯德移液管进一步吹打组织悬液10次。若仍有较大的组织块残留，可用移液管尖端轻轻将组织块压向管底，并持续吹打直至细胞形成均匀的细小悬液。
9. 将组织在37 °C继续孵育10分钟，并重复之前的混匀步骤。

4. 干细胞的免疫标记

1. 将离心管置于冰上，并在后续步骤中使用预冷的冰上溶液。将解离的细胞通过40 μm细胞筛过滤至50 mL离心管中。向滤器中加入10.0 mL HBSS溶液，以确保细胞在额外溶液中顺利通过滤网。
2. 将过滤后的细胞转移至新的15 mL离心管中，在4 °C条件下以300 × g离心10分钟。使用真空吸管小心地吸除并弃去全部上清液。
3. 用160 μL磁珠分选柱缓冲液重悬细胞沉淀。为在磁性标记前获得单细胞悬液，需将细胞通过30 μm尼龙滤网，以去除细胞团块，防止堵塞分选柱。
4. 向每个15 mL离心管中加入40 μL抗prominin-1微珠，混匀后于冰箱中孵育15分钟，使抗体与表达prominin-1的细胞结合。
5. 加入1.0–2.0 mL分选柱缓冲液X洗涤细胞，在300 × g条件下离心10分钟。彻底吸除上清液。
6. 用1.0 mL分选柱缓冲液X重悬细胞沉淀。
   注意：若在用1.0 mL分选柱缓冲液X重悬沉淀后观察到小团块，应使用巴斯德吸管尖端小心去除，否则这些团块可能在细胞分选过程中堵塞磁性分选柱。

5. 磁性柱制备、细胞分选与铺板

注意：不同基因型条件（疾病组 vs. 对照组）的磁分离必须同时进行，因为任何延迟都可能影响神经球的形态。

1. 将磁性柱置于磁力架上，使其暴露于磁场中，以准备磁性柱。加入500 μL缓冲液X冲洗柱子一次，冲洗液滴入离心管中后弃去。
   注意：每次实验均需新鲜配制磁性柱缓冲液X；若未新鲜配制，则干细胞得率将降低。
2. 将标记后的细胞悬液加至柱上。收集流穿液，其中含有未标记的细胞，主要为小脑神经元/胶质细胞混合细胞，并将其收集至新的15 mL离心管中（图1A）。
3. 用500 μL缓冲液X洗涤柱子3次（每次洗涤约需2–4分钟）。
   注意：富含小脑颗粒神经元的小脑神经元/胶质细胞混合培养物可作为此纯化步骤的有用副产物。
4. 将柱子从磁场中移开，并放入1.5 mL离心管中。向柱内加入1.0 mL培养基（神经球培养基），并将推杆插入柱中，将带有prominin-1磁珠标记的细胞洗脱至新的1.5 mL离心管中。
5. 为提高prominin-1标记细胞的纯度，可将洗脱后的细胞按照步骤5.1–5.4再通过第二个柱子进行纯化。
6. 使用血细胞计数板对细胞进行计数。通常每只小脑可获得约10⁷个细胞。将细胞接种至超低吸附培养板中（6孔或12孔板，根据下游实验所需的密度决定）。

6. 神经球的传代与分化

1. 将标记了prominin-1的干细胞以神经球培养基接种于超低吸附12孔板中（每孔5,000个细胞）。
2. 培养7–10天后，细胞分裂形成球形漂浮的神经球（初级神经球）。
   注意：本实验中，为后续使用将扩增产生次级神经球。初级神经球群体不用于这些实验，因其可能含有不具备干细胞特性的污染细胞，且这些细胞可与神经球聚集成团。
3. 传代时，使用1.0 mL移液器吸头将初级神经球连同培养基转移至15 mL无菌离心管中。在300 ×g条件下离心5分钟，沉淀神经球，并弃去上清液。
4. 将沉淀重悬于5 mL含有木瓜蛋白酶或0.05%胰蛋白酶溶液的组织解离液中，在37 °C孵育10分钟。
5. 将细胞悬液在300 ×g条件下离心5分钟。将细胞重悬于5 mL神经球培养基中，并使用塑料巴斯德移液管通过缓慢吹打10次进行机械解离。
6. 按照前述方法再次将细胞接种于神经球培养基中。培养7–10天后，培养板中应富含次级神经球。
   注意：这些培养物可高效传代多达8次，之后神经球尺寸趋于变小，提示增殖能力下降。
7. 使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将适量数量的细胞接种至多聚-D-赖氨酸包被的培养板（6孔或12孔板）中，用于后续实验。
8. 为诱导干细胞分化，按照前述方法通过离心收集第二至第八代的神经球，但向沉淀中加入分化培养基。
   注意：体外培养7天后，干细胞可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，可通过神经元标志物β-III微管蛋白、星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）以及少突胶质细胞标志物O4染色加以证实。

结果

图 1：从出生后小脑中分离 prominin-1 阳性干细胞。（A）利用免疫磁珠法通过 prominin-1 磁珠从小脑中分离干细胞。上图：纯化的干细胞（结合于柱上）形成具有广泛增殖能力和自我更新特性的神经球。未结合于柱上的细胞（流穿组）无法形成神经球；相反，它们分化为小脑神经元/胶质细胞混合群体（β-III 微管蛋白/GFAP 阳性）。下图：由表达干细胞特异性标记物的 prominin-1⁺ 细胞形成的神经球，包括 Nestin、prominin-1 和 GFAP。（B）流穿组细胞对干细胞标记物 prominin-1 和 ne...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.05% 胰蛋白酶	Thermo Fisher Scientific	25300054	0.05%
2% B27	Gibco; Thermo Fisher Scientific	17504001
2 mM EDTA 溶液	Corning	46-034-CI
抗-CD133微珠	Miltenyi Biote	130-092-333
牛血清白蛋白	Sigma	A9418
多联柱支架	Miltenyi Biotec	130-042-303
超低吸附培养板	Corning	3473
半胱氨酸	Sigma	C7880
脱氧核糖核酸酶（DNase）	Sigma	D4513-1VL	250 U/ml
杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco's Phosphate Buffer Saline）	Thermo Fisher Scientific	14040141
Hank's 平衡盐溶液（HBSS）	Gibco	14025-092
人重组碱性成纤维细胞生长因子	Promega	G507A	20 ng/ml
人重组表皮生长因子	Promega	G502A	20 ng/ml
白血病抑制因子（LIF）	Sigma	L5158
L-谷氨酰胺	Gibco	25030081
显微镜	Lieca TCS SP5 共聚焦显微镜
MiniMACS 分离器	Miltenyi Biotec	130-042-102
小鼠抗-CD133抗体	Affymetrix eBioscience	14-1331	1:100
巢蛋白（Nestin）	Abcam	ab27952	1:200
Neurobasal 培养基	Thermo Fisher	25030081
O4	Millopore	MAB345
木瓜蛋白酶（Papain）	Worthington	LS003126	(100 U/ml)
血小板源性生长因子	Sigma	H8291	10 ng/ml
聚-D-赖氨酸	Sigma	P6407
兔抗-微管蛋白 β-III	Sigma	T2200	1:500
兔抗-GFAP	Dako	Z0334	1:500
分离柱-MS柱	Miltenyi Biotec	130-042-201
无菌细胞筛	Fisher Scientific	22363547	40 µm