从小鼠出生后小脑中分离干细胞并诱导其分化为神经细胞

摘要

来源：Edamakanti, C. R., 等 从出生后小鼠小脑中纯化Prominin-1⁺干细胞。J. Vis. Exp. (2020)。

本视频展示了一种从出生后小鼠小脑中分离干细胞并将其分化为神经细胞的方法。利用抗体包被的磁珠从分离的细胞悬液中纯化干细胞，并进行培养以形成神经球。随后将神经球维持在分化培养基中，以诱导生成神经细胞。

方案

1. 溶液的配制

1. 制备组织解离液：使用含酚红的无菌杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS），并加入木瓜蛋白酶（100 U/mL）、半胱氨酸（0.2 mg/mL）和脱氧核糖核酸酶（DNase，250 U/mL）。
2. 配制DNase溶液：将一瓶冻干粉末DNase I（100 mg）溶于50 mL H₂O中，充分混匀后过滤，得到母液。将母液分装为每管10 mL的储存液，再将其中一管进一步分装为每管0.5 mL的单次使用 aliquot。单次使用分装液储存于-80 °C。
3. 通过配制磁性分离柱缓冲液X来准备磁性分离试剂：含0.5%牛血清白蛋白（BSA）和2 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的溶液。
4. 配制神经球培养基：使用含青霉素/链霉素和L-谷氨酰胺的Neurobasal培养基，并添加2% B27、20 ng/mL人重组表皮生长因子（EGF）和20 ng/mL人重组碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）。
5. 配制分化培养基：使用Neurobasal培养基，并添加10 ng/mL分化因子血小板源性生长因子（PDGF-AA）或10 ng/mL白血病抑制因子（LIF），以及2% B27。
6. 使用超低吸附性的12孔（3.5 cm²）和6孔（9.6 cm²）培养板。

2. 小....

结果

图 1：从出生后小脑中分离 prominin-1 阳性干细胞。（A）利用免疫磁珠法通过 prominin-1 磁珠从小脑中分离干细胞。上图：纯化的干细胞（结合于柱上）形成具有广泛增殖能力和自我更新特性的神经球。未结合于柱上的细胞（流穿组）无法形成神经球；相反，它们分化为小脑神经元/胶质细胞混合群体（β-III 微管蛋白/GFAP 阳性）。下图：由表达干细胞特异性标记物的 prominin-1⁺ 细胞形成的神经球，包括 Nestin、prominin-1 和 GFAP。（B）流穿组细胞对干细胞标记物 prominin-1 和 ne.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.05% 胰蛋白酶	Thermo Fisher Scientific	25300054	0.05%
2% B27	Gibco; Thermo Fisher Scientific	17504001
2 mM EDTA 溶液	Corning	46-034-CI
抗-CD133微珠	Miltenyi Biote	130-092-333
牛血清白蛋白	Sigma	A9418
多联柱支架	Miltenyi Biotec	130-042-303
超低吸附培养板	Corning	3473
半胱氨酸	Sigma	C7880
脱氧核糖核酸酶（DNase）	Sigma	D4513-1VL	250 U/ml
杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco's Phosphate Buffer Saline）	Thermo Fisher Scientific	14040141
Hank's 平衡盐溶液（HBSS）	Gibco	14025-092
人重组碱性成纤维细胞生长因子	Promega	G507A	20 ng/ml
人重组表皮生长因子	Promega	G502A	20 ng/ml
白血病抑制因子（LIF）	Sigma	L5158
L-谷氨酰胺	Gibco	25030081
显微镜	Lieca TCS SP5 共聚焦显微镜
MiniMACS 分离器	Miltenyi Biotec	130-042-102
小鼠抗-CD133抗体	Affymetrix eBioscience	14-1331	1:100
巢蛋白（Nestin）	Abcam	ab27952	1:200
Neurobasal 培养基	Thermo Fisher	25030081
O4	Millopore	MAB345
木瓜蛋白酶（Papain）	Worthington	LS003126	(100 U/ml)
血小板源性生长因子	Sigma	H8291	10 ng/ml
聚-D-赖氨酸	Sigma	P6407
兔抗-微管蛋白 β-III	Sigma	T2200	1:500
兔抗-GFAP	Dako	Z0334	1:500
分离柱-MS柱	Miltenyi Biotec	130-042-201
无菌细胞筛	Fisher Scientific	22363547	40 µm