量化颅脑放射治疗引起认知功能下降

摘要

由脑肿瘤放射治疗引起的认知功能障碍是一种临床上难以解决的病症，会严重影响患者的生活质量。要有效评估可能缓解辐射所致认知减退的干预措施，最终依赖于能否对认知功能进行严格的定量评估。

摘要

除生存率外，由癌症临床治疗引发的认知功能障碍是决定治疗效果的主要因素之一。对于许多患有中枢神经系统（CNS）及非中枢神经系统恶性肿瘤的患者而言，放疗和化疗是控制疾病的最佳手段。然而，这些治疗手段也伴随着代价，几乎所有癌症幸存者（截至2006年，仅美国就约有1100万人）均存在一定程度的认知功能障碍风险，其中接受颅脑放疗（每年约20万人）以控制原发性或转移性脑肿瘤的患者风险最为严重¹。尤其令人担忧的是儿童病例，其长期生存常伴随显著的认知能力下降，导致沉重的社会经济负担²。迄今为止，这一重要的临床问题仍无令人满意的解决方案。

我们已采用移植干细胞的方法，应对颅脑照射后无胸腺大鼠出现的辐射诱导认知功能下降这一严重健康问题³。立体定向照射以及人源神经干细胞（hNSCs）的体外培养与移植操作的详细步骤，可参见我们的配套论文（Acharya 等，JoVE 参考文献）。在完成照射与细胞移植手术后，我们于照射后1个月和4个月时，评估大鼠认知功能的变化、移植物细胞的存活情况以及特定分化标志物的表达水平。为了严格评估任何旨在缓解辐射所致认知后遗症的干预措施的有效性或失败原因，必须进行一系列严谨的定量认知行为测试。为此，我们对实验动物实施了一系列认知测试范式，包括新位置识别、水迷宫、高架十字迷宫和恐惧条件反射，以量化海马依赖性与非海马依赖性的学习与记忆功能。我们已证实这些测试在量化照射动物特定类型认知功能减退方面的有效性，并利用这些方法证明，接受hNSCs移植的动物在认知功能方面表现出显著改善³。

移植的人类干细胞所带来的认知功能益处表明，类似策略或许有朝一日可为认知功能受损的癌症幸存者提供亟需的临床干预手段。因此，我们提供了认知测试范式中关键步骤的书面和可视化记录，以促进这些具有前景的研究成果向临床应用的转化。

方案

我们的认知测试范式如图1所示。认知测试在放射处理和手术操作完成后一个月开始进行。

进行新位置识别（NPR）任务

1. 新位置识别（Novel Place Recognition，NPR）任务基于Mumby及其同事（2002年）描述的方法，是一种依赖海马体的空间识别记忆任务⁴。
2. 大鼠首先通过将其放置于测试环境中进行熟悉，测试环境为定制的白色亚克力开放式箱子（70 cm × 70 cm × 40 cm 高），每天一次，每次20分钟，连续三天。在适应期中，将不用于后续测试的物体放置于环境中。
3. 在适应阶段，应手动记录探索行为的观察结果，无需进行行为录像或轨迹追踪。
4. 在NPR任务的所有阶段中，每次更换动物后均需使用70%乙醇彻底清洁测试环境，以尽量减少气味线索的干扰。所有试验中，实验人员应以一致的方向将动物放置于测试环境的中央，以降低动物仅因靠近某物体而优先探索该物体的可能性。
5. 熟悉阶段和5分钟测试阶段均在第四天进行。
6. 在熟悉阶段，将两个完全相同的塑料块（8 cm × 3 cm × 10 cm 高）经70%乙醇彻底清洁后，放置于测试环境中的特定位置。每只动物单独放入一个环境中，持续5分钟，自由探索。
7. 使用自动追踪系统对两个同等熟悉的空间位置的探索行为进行评分。在所有阶段中，探索行为定义为动物鼻尖位于物体4 cm半径范围内，并朝向该物体。
8. 熟悉阶段结束后，将动物转移至小型暂养笼中，进行5分钟的延迟间隔。在此期间，使用70%乙醇清洁测试环境，并添加一组相同的塑料块：一个放置于熟悉阶段的相同空间位置，另一个放置于新的、陌生的空间位置。若大鼠记住了熟悉阶段中物体的空间排列，则其会花更多时间探索位于新空间位置的物体。
9. 5分钟延迟间隔结束后，将动物重新放回测试环境中，进行5分钟测试阶段，自由探索3分钟。
10. 在熟悉阶段结束24小时后，动物再次被放回测试环境中进行24小时测试阶段。此阶段中，一个物体保持与熟悉阶段及5分钟测试阶段相同的位置，另一个物体则被放置于一个新的、陌生的空间位置。同样，若大鼠记住了前一天熟悉阶段中物体的空间排列，则其会花更多时间探索位于新空间位置的物体。
11. 此时，使用自动追踪程序收集动物在不同空间位置探索物体的时间，并可对实验组间的数据进行统计学分析。
12. 在熟悉阶段，计算整个试验过程中动物探索两个空间位置的总时间。此阶段中，动物探索两个空间位置的时间应无显著差异，因为这两个位置对动物而言具有相同的熟悉程度（图2A）。此外，实验组间总探索时间的显著差异可能提示组间在探索动机或焦虑水平方面存在差异，在解释两个测试阶段的空间识别记忆结果时应予以考虑。
13. 在5分钟和24小时测试阶段，均按以下公式计算探索比例：（探索新位置的时间 - 探索熟悉位置的时间）/ 总探索时间（图2B）。该方法可消除个体间探索动机的差异。正常动物在5分钟和24小时延迟间隔后，探索新空间位置的时间显著高于随机预期值（由虚线表示）（图2B）。
14. 探索比例通常基于5分钟和24小时测试的前60秒数据进行计算⁴。这是因为随着测试的进行，新空间位置对动物而言逐渐变得熟悉。因此，测试的前一分钟能最准确地评估空间识别记忆。

2. 进行高架十字迷宫（EPM）实验

1. 高架十字迷宫（Elevated Plus Maze, EPM）实验基于 Walf 和 Frye 于 2007 年建立的方法⁵。
2. EPM 实验用于评估啮齿类动物的焦虑行为。EPM 装置为一个四臂迷宫（45 英寸 × 4 英寸），离地高度为 45 英寸，四臂呈十字形排列，其中两个臂为封闭臂，另两个为开放臂。图中所示装置由 Med Associates 公司生产。
3. 动物在此任务中的行为反映了其探索新环境的自然动机（在开放臂中停留的时间）与偏好待在受保护区域（封闭臂）之间的冲突。
4. 实验房间使用聚光灯照射迷宫，光线明亮，以确保动物有足够的动机选择更昏暗的封闭臂。
5. 在测试第一只动物前以及每次试验之间，均需彻底清洁迷宫。
6. 将动物双手托住前肢，放置于迷宫中央区域，使其面朝远离实验操作者的开放臂。每次试验持续 5 分钟。
7. 使用自动追踪软件记录动物运动轨迹，以计算其进入开放臂和封闭臂的次数以及在各臂停留的时间。还可观察其他行为，如直立、理毛以及将头部探出装置边缘的动作。当动物身体中心点进入某一臂时，记为一次进入。
8. 若大鼠从迷宫掉落，应迅速将其放回掉落时所在的开放臂，并在观察记录本中记录该事件。若大鼠长时间僵直不动，需记录该行为及其可能原因（e.g. 实验室外突然出现的巨大声响），并继续测试，以确保所有实验动物的暴露时间一致。
9. 通过计算动物在开放臂与封闭臂的停留时间比例（开放臂时间 / 臂内总时间），以及进入开放臂次数与总入臂次数的比例，来评估焦虑水平。利用自动追踪软件还可测量总移动距离和移动速度，以评估不同实验组之间在运动功能上的差异。
10. 在开放臂中停留时间比例越高，表明焦虑程度越低；而在封闭臂中停留时间越长，则提示焦虑和恐惧程度增加。正常动物在开放臂中停留的时间显著少于随机预期值（由虚线表示，图 3）。焦虑程度更高的动物在开放臂中停留的时间更少，而焦虑程度较低的动物则在开放臂中停留更长时间（例如，在多次接触迷宫后或给予抗焦虑药物处理后）。

3. 进行情境与线索恐惧条件反射（FC）任务

1. 情境性与线索性恐惧条件反射（FC）任务的描述基于 Schafe 等人，1999 年；Winocur 等人，2006 年；以及 MacLeod 等人，2007 年的研究方法^6-8。
2. 恐惧条件反射（FC）任务是一种行为范式，动物通过将原本中性的刺激（如环境、光或声音；即条件刺激）与有害刺激（通常为轻微足底电击；即非条件刺激）配对，从而学会对该中性刺激产生恐惧。该学习过程迅速、显著且持久，因此 FC 任务常用于研究啮齿类动物学习与记忆的神经生物学回路。
3. FC 实验装置为一个高 30 cm × 宽 30 cm × 深 40 cm 的封闭腔室（Phenotyper，型号 3000，Noldus Information Technology）。腔室底部由不锈钢栅格构成，用于传递电击刺激。Phenotyper 配备一个扬声器，可根据需要发出 2300 Hz、90 dB 的声音，作为条件刺激。
4. 电击通过电击发生器（Med Associates Inc.）传递。该电击仅引起短暂不适，不会造成持续性疼痛或组织损伤。在训练和测试试验中，电击和声音刺激的传递时间均由 Ethovision XT 附加模块中的试验与硬件控制模块（版本 7.0；Noldus Information Technology）自动定时和控制。
5. 在第一天进行 FC 训练。使用 70% 乙醇彻底清洁 Phenotyper 腔室后，将单只动物放入其中。训练试验包括三个阶段：（1）基线期，不给予电击或声音；（2）训练期，呈现声音-电击配对；（3）训练后期，不再给予电击或声音。每个阶段持续约 5 分钟，每只动物的总训练时间为 15 分钟。
6. 在训练阶段，声音持续 30 秒，在声音结束的同时，向栅格施加 1 mA、持续 1 秒的电击。此声音-电击配对共重复 5 次，每次配对之间的间隔为 10 至 60 秒的可变时间。
7. 从训练阶段的数据中，测量每只动物在初始基线期最后 60 秒内静止不动（即“僵直”）的时间百分比（以确定声音-电击配对前的自发僵直水平），以及训练后期最后 60 秒内的僵直时间百分比（以评估对声音-电击配对的僵直反应）。正常动物在基线期表现出极低水平的僵直，而在训练后期则表现出极高（约 95%）的僵直水平（图 4）。
8. 24 小时后，将动物重新放回相同环境，进行为期 5 分钟的情境性 FC 测试。此阶段不施加电击或声音，计算整个试验期间僵直时间所占百分比。需注意从训练到情境测试期间保持环境一致性的重要性。实际上，由同一名实验人员在两天内负责处理和测试动物是必要的。正常动物在情境测试中约有 70% 的时间处于僵直状态（图 4）。
9. 一小时后进行线索性 FC 测试。通过移除栅格地板、在腔室外侧添加遮挡板，并用带香味的家用清洁剂清洁地面，以改变腔室环境。观察动物在第一分钟内的僵直行为，若环境改变充分，则僵直水平应非常低（图 4）。随后播放声音 3 分钟，再静默 1 分钟，计算僵直时间所占百分比。正常动物在此期间表现出高水平的僵直（图 4）。
10. 总共收集五项独立的僵直行为测量指标：（1）基线期；（2）训练后期；（3）情境测试；（4）线索前测试；（5）线索及线索后测试。
11. 基线期无僵直行为表明动物焦虑水平正常，而训练后期出现显著僵直提示感觉-运动功能完好。情境测试中的僵直行为反映了对训练环境的 24 小时记忆，该记忆依赖于海马和杏仁核功能的完整性⁹。线索前测试中缺乏僵直表明初始训练环境已得到充分改变。线索及线索后僵直反映了对声音刺激的 24 小时记忆，该记忆依赖于杏仁核功能的完整性⁹。

4. 进行莫里斯水迷宫（MWM）实验

1. 莫里斯水迷宫任务的操作程序基于先前的描述^10,11。
2. 莫里斯水迷宫（MWM）任务是一种用于啮齿类动物的空间学习测试，要求动物利用远端线索在盛有不透明水的大水池中找到隐藏的逃生平台。在水池周围特定且固定的位置放置大型、明显的视觉线索。动物通过学习利用这些线索导航至隐藏平台。若动物无法游泳，需对其进行监测并及时从水中移出。
3. 通过多次试验评估空间学习能力，通过在平台移除后评估动物对原平台区域的偏好来确定参考记忆。逆转试验有助于检测空间功能障碍，并可能额外涉及前额叶皮层等脑区¹⁰。
4. MWM任务持续8天，分为4个阶段：提示测试、获得阶段、24小时探测试验和逆转学习测试。
5. 水池为定制的白色聚乙烯水箱，直径200 cm，高60 cm。注入约30 cm深的水，并加入白色无毒颜料使其不透明。水温维持在20至22°C（68至72°F）。逃生平台为定制透明塑料支架，顶部为直径10 cm的圆形，位于水面以下约1.5 cm处。
6. 提示测试在第1天进行，共4次试验。在这些试验中，平台中央放置一个醒目的黑白旗帜，使逃生位置对动物明显可见。为减少此阶段对空间信息的使用，移除墙壁上的线索，并在每次试验中改变平台和起始位置。此阶段有助于在获得阶段开始前排除实验组之间可能存在的感觉-运动相关差异。
7. 在MWM任务的所有阶段中，动物均在前肢下方被轻轻握住，面朝池壁放入指定的起始位置。动物以每批8只为一组进行测试，每天4次试验之间保持8至10分钟的试验间间隔。在试验间隔期间，动物被置于保温箱中以防止体温过低。
8. 在提示测试中，允许动物最长游泳30秒以登上平台。若在规定时间内未能逃脱，实验人员用手引导动物至平台并将其放置于平台上。动物在平台上停留20秒休息后，再放入保温箱。
9. 每次提示测试试验中，动物从池周不同且预先确定的起始位置入水，平台也依次移至4个不同象限的位置。
10. 获得阶段从次日开始，连续5天，每天进行4次试验。在此阶段，隐藏平台位置保持不变，动物通过利用环境中的远端线索学习导航至平台。
11. 同样，在每天的4次试验中，动物从不同且预先确定的起始点入水。每天有两个起始点位于平台左侧，两个位于右侧，顺序随机，以避免动物发展出以自我为中心的空间策略来完成任务。
12. 每次获得试验的最大游泳时间为60秒，超时后由实验人员引导动物至平台并将其放置其上。动物在逃脱后需在平台上停留20秒。
13. 第7天，在最后一次训练试验24小时后，进行一次60秒的探测试验，期间移除平台。此阶段用于评估动物对原平台所在象限的偏好，作为空间参考记忆的衡量指标¹⁰。探测试验结束后，将平台放回原象限，并进行3次常规获得试验。
14. 第8天进行逆转学习测试，平台被移至新的位置，以评估动物的逆转学习能力。通过测量动物在原位置与新位置搜索平台所花费的时间，可评估其固执性，即平台移动后仍无法抑制对原位置反应的能力¹⁰。与获得阶段和探测阶段相同，共进行4次60秒的试验。
15. 在提示测试中，以找到平台的潜伏期和运动速度分别作为视觉功能和运动功能的衡量指标。在解释获得阶段和记忆结果时，必须考虑实验组在此阶段的差异，因为组间可能存在感觉-运动功能的差异。
16. 在获得阶段，以找到平台的平均潜伏期和/或路径长度作为空间学习的衡量指标。在正常动物中，随着五天获得阶段的进行，逃脱潜伏期逐渐缩短，至第5天时平均逃脱时间约为15至20秒（图5A）。
17. 在探测阶段，以到原平台位置的平均距离（图5B）和/或首次到达原平台位置的潜伏期（图5C）作为空间参考记忆的衡量指标。
18. 在逆转阶段，以在原象限与新象限（含平台）停留时间的百分比作为固执性的衡量指标。随着四次试验的进行，对原平台位置的偏好应逐渐降低，而对新位置的偏好逐渐建立（图5D）。

5. 代表性结果：

图1. 认知测试范式的示意图。

图 2. 对照动物在新位置识别任务中的代表性结果。A) 在熟悉阶段，动物花在探索两个不同空间位置上的总时间应大致相等。B) 探索比率（探索新位置的时间 / 探索两个位置的总时间）在5分钟和24小时延迟间隔后均显示出对新空间位置的明显偏好。虚线表示随机水平的表现。

图3. 对照组动物在高架十字迷宫中的典型实验结果。正常动物在开放臂中停留的时间少于随机预期值（由虚线表示）。与对照组相比，焦虑动物在开放臂中停留的时间比例更少；而多次暴露于迷宫环境或给予抗焦虑药物处理，则会增加动物在开放臂中停留的时间。

图4. 对照组动物在恐惧条件反射任务中的代表性结果。在初次进入实验箱时（基线期）以及在提示测试前改变环境后（提示前测试），动物的冻结行为水平较低。相比之下，正常动物在训练后阶段大部分时间都表现出冻结行为。如果动物在24小时延迟后仍记得训练发生时的情境，则在5分钟的情境测试中约有70%的时间表现出冻结行为。同样，如果动物记住了声音提示，则在提示测试及提示后测试期间也会表现出高水平的冻结行为。

图5. 对照组动物在Morris水迷宫任务中的代表性结果。A) 在习得阶段，随着训练的进行，逃避潜伏期逐渐缩短。B) 和 C) 在24小时探针测试中，动物首次穿越原平台位置的平均距离和潜伏期被用作空间参考记忆的评估指标。D) 逆转学习通过在测试的最后一天改变平台位置来评估。在4次试验中，正常动物逐渐停止在原象限搜索，并学会平台已移动至新的位置。

讨论

迫切需要制定长期策略，以预防癌症幸存者中日益普遍的认知功能障碍^12,13。干细胞治疗可能为改善中枢神经系统（CNS）中一系列正常组织继发性损伤提供途径，因其具备替换因细胞毒性癌症治疗而丢失或受损细胞的潜力¹⁴。为了加速实现这一目标，我们开展了一系列原理性验证实验，证实了颅内移植人神经干细胞（hNSCs）能够在经照射的中枢神经系统组织环境中功能性地恢复认知能力³。实现这一目标的关键在于能够以可重复的方式可靠地实施一系列严格控制的认知功能测试。我们已详细阐述了这些关键实验步骤，旨在加快干细胞疗法在临床中的转化应用。以下将重点说明可能对数据质量产生显著影响的其他注意事项。

认知测试需要细致入微的关注，遵循某些标准操作规程有助于最大限度地减少干扰结果解读的人为因素。最好使用独立于动物饲养室和实验人员的专用行为测试房间。同时建议使用“白噪声”来屏蔽动物设施中的外界噪音，以免干扰动物完成当前任务。为了尽量减少接受认知测试动物的应激反应，重要的是在任务实施前让动物熟悉将要进行行为测试的实验人员。通常情况下，如果需要同时测试雌性和雄性动物，建议优先测试雌性，因为若测试环境中残留雄性气味线索，雌性在测试过程中往往表现出更高的焦虑水平。在实施一系列连续测试任务时，应先让动物接受应激性较低的任务（如高架十字迷宫实验EPM、新物体识别实验NPR），最后进行应激性较高的任务（如恐惧条件反射FC、莫里斯水迷宫MWM）。