视网膜神经节神经元与嗅鞘胶质细胞的共培养

摘要

来源：Portela-Lomba, M., 等. 轴突切断的大鼠视网膜神经节细胞与嗅鞘施万细胞共培养，作为一种 体外 成年轴突再生模型 视频实验杂志 (2020)

本视频演示了从大鼠视网膜中分离视网膜神经节细胞（RGNs）并将其与嗅鞘施万细胞（OEG）共培养的实验步骤。该方法可用于研究神经损伤后OEG细胞的神经再生潜力。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 检测用ihOEG（Ts12和Ts14）的制备

注意： 此步骤必须在 RGN 切取和共培养前 24 小时完成。

1. 处理 12 mm Ø 带有10的盖玻片 µg/mL 多聚-L-赖氨酸（PLL）孵育 1 小时。
   注意： 盖玻片可在PLL溶液中放置过夜。
2. 用1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤盖玻片三次。
3. 从 p60 细胞培养皿上分离 Ts12 和 Ts14 ihOEG 细胞。
   1. 向15 mL锥形管中加入4 mL DMEM/F12（基础培养基）-FBS（胎牛血清）培养液，在37 °在洁净的水浴中，温度为 C。
   2. 从培养板中移除培养基，用1 mL 1× PBS（磷酸盐缓冲盐水）-EDTA（乙二胺四乙酸）洗涤细胞一次。
   3. 向OEG细胞中加入1 mL胰蛋白酶-EDTA，于37℃孵育3–5分钟 °C，5% CO₂.
   4. 用 p1000 移液器收集细胞，并转移至步骤 2.1 中准备的培养基中。
   5. 200 × g 离心 5 分钟 g.
   6. 吸除上清液。
   7. 加入1 mL ME10培养基，重悬沉淀。
   8. 使用血细胞计数板对细胞数量进行计数。
4. 在24孔板中，每孔加入500 µL培养基，接种80,000个Ts14细胞或100,000个Ts12细胞至盖玻片上 µME10 培养基 L
5. 在37℃下培养细胞 °C，5% CO₂₂ 24小时。

2. 视网膜组织解剖

注意：使用2月龄雄性Wistar大鼠作为RGN来源。每只大鼠的两个视网膜用于24孔细胞培养板中的20个孔。手术器械使用前需高压灭菌。木瓜蛋白酶解离试剂盒为商业购买（材料表）。请按照供应商提供的说明进行试剂重悬。将D, L-2-氨基-5-磷酸戊酸（APV）重悬为5 mM的储存液，并分装成小份。

1. 在实验当天，配制以下培养基。
   1. 在 p60 细胞培养皿中加入 5 mL 冷的 EBSS（Earle's 平衡盐溶液）（ papain 解离试剂盒中的第 1 管）。
   2. 在另一个 p60 细胞培养皿中加入重组后的 papain 解离试剂盒第 2 管（papain）以及 50 µL APV，然后加入 250 µL 重组后的第 3 管（DNase 加 5 µL APV）。
   3. 在无菌离心管中，将 2.7 mL 第 1 管溶液与 300 µL 第 4 管溶液（卵白蛋白-卵黏蛋白蛋白酶抑制剂）混合，再加入 150 µL 第 3 管溶液（DNase）和 30 µL APV。
   4. 配制 20 mL Neurobasal-B27 培养基（NB-B27）。
2. 用 CO₂ 窒息法处死一只大鼠。
3. 使用剪刀断头取下大鼠头部，将其放入 100 mm 培养皿中，并用 70% 乙醇喷洒头部，随后置于超净工作台内。
4. 用剪刀剪除大鼠的胡须，以免干扰眼部操作。
5. 用镊子夹住视神经，将眼球轻轻拉出，以便使用手术刀在眼球上做切口。
6. 取出晶状体和玻璃体，并将视网膜（呈橙色组织）完整剥离，其余眼组织层（包括色素上皮层）保留在原位。
7. 将视网膜放入步骤 2.1.1 中准备好的 p60 细胞培养皿中。
8. 将视网膜转移至步骤 2.1.2 中准备好的 p60 细胞培养皿中，用手术刀将其切成大小约 < 1 mm 的小块。
9. 转移至 15 mL 塑料离心管中。
10. 将组织在 37 °C、5% CO₂ 的湿润培养箱中孵育 30 分钟，每 10 分钟轻轻振荡一次。
11. 使用玻璃巴斯德吸管反复吹打，使细胞团块解离。
12. 将细胞悬液在 200 x g 条件下离心 5 分钟。
13. 弃去上清液。为灭活 papain，将细胞沉淀重悬于步骤 2.1.3 配制的溶液中（每 2 只眼使用 1.5 mL）。
14. 小心地将该细胞悬液加入含 5 mL 重组第 4 管溶液的容器中。
15. 在 200 x g 条件下离心 5 分钟。
16. 离心期间，彻底移除 OEG 24 孔细胞培养板（此前已在步骤 1 中准备）中的 ME-10 培养基，并向每孔加入 500 µL NB-B27 培养基。
17. 弃去上清液，将细胞重悬于 2 mL NB-B27 培养基中。
18. 将 100 µL 视网膜细胞悬液接种至 m24 孔板的每一孔中，接种于 PLL 处理的或 OEG 单层覆盖的盖玻片上。
19. 在 NB-B27 培养基中，于 37 °C、5% CO₂ 条件下维持培养 96 小时。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
B-27 补充剂	Gibco	17504044
D,L-2-氨基-5-磷酰戊酸	Sigma	283967	NMDA 受体抑制剂
DMEM-F12	Gibco	11320033	细胞培养基
FBS	Gibco	11573397	胎牛血清
FBS-Hyclone	Fisher Scientific	16291082	胎牛血清
L-谷氨酰胺	Lonza	BE17-605F
Neurobasal 培养基	Gibco	21103049	神经元细胞培养基
木瓜蛋白酶解离系统	Worthington Biochemical Corporation	LK003150	用于神经细胞分离
PBS	自制
PBS-EDTA	Lonza	H3BE02-017F
青霉素/链霉素/两性霉素 B	Lonza	17-745E	抑菌和杀菌剂
垂体提取物	Gibco	13028014	牛垂体提取物
多聚-L-赖氨酸 (PLL)	Sigma	A-003-M