一种从大鼠头肌组织中分离卫星细胞的技术

摘要

来源：Carvajal Monroy, P. L.，等。大鼠头部鳃弓肌卫星细胞的分离与鉴定。J. Vis. Exp. (2015)。

本视频展示了通过组织解剖、酶消化以及后续的机械和离心纯化方法，从大鼠头部鳃弓肌组织中分离卫星细胞的过程。随后将细胞接种于经细胞外基质包被的培养孔中，使其分化为成肌细胞，并最终形成肌管和成熟的肌纤维。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 细胞外基质凝胶点

1. 在分离前一日执行以下步骤：
   1. 在 4 °C 条件下解冻一份细胞外基质凝胶（100 μl），时间不少于 1.5 小时。用含 4,500 mg/L 葡萄糖、4 mM L-谷氨酰胺和 110 mg/ml 丙酮酸钠的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）将凝胶按 1:10 比例稀释。细胞外基质凝胶始终需保持在 4 °C 条件下。
      注意：温度的急剧变化将导致包被不均匀及晶体形成。
   2. 将稀释后的细胞外基质凝胶溶液置于冰上 15 分钟。
   3. 将一支 20 μl 微量移液器预先冷却 10 分钟。
   4. 将 8 孔培养腔载玻片放入一个 100 mm 皿中，并将该皿置于冷表面（例如冷冻包）上 10 分钟。
   5. 使用预冷的微量移液器，在每个孔中加入 10 μl 细胞外基质凝胶液滴。将培养皿继续保留在冷表面上至少再 7 分钟（图 1A）。
   6. 彻底移除残留的细胞外基质凝胶（图 1B），并在 37 °C 下过夜干燥各孔。

2. 头部肌肉（咬肌、二腹肌和腭帆提肌）的解剖

1. 解剖前，准备 50 ml 含 2% 青霉素-链霉素（P/S）的磷酸盐缓冲液（PBS），并置于冰上。
2. 使用 CO₂/O₂ 对一只年轻成年大鼠（9 周龄）实施安乐死后，将其头部切断，并去除头面部皮肤。将头部转移至含有 2% P/S 的冰冻 PBS 中，置于 50 ml 离心管内。
3. 咬肌（来源于第一鳃弓）
   1. 将头部一侧朝上放置于硅胶垫上，并用注射针头固定（图 2A）。
   2. 辨认腮腺和面神经（图 2A），暴露覆盖该腺体的深筋膜。用解剖剪剪开筋膜并移除腮腺。辨认外耳道，从茎乳孔处追踪面神经，并用 15 号手术刀片小心地去除颞支、颧支和颊支。
   3. 通过去除筋膜游离咬肌的浅头，辨认咬肌的浅头和深头。沿浅头追踪，直至其厚实的腱性腱膜止于上颌骨的颧突。
   4. 用直镊子分离该腱在颧突起点处的附着，使用 15 号手术刀片或解剖剪将其切断，并小心提起（图 2B）。
   5. 使用 15 号手术刀片沿咬肌浅头向其在下颌支角部及外侧面下半部分的止点进行解剖（图 2C），随后将该肌肉完全移除。
4. 二腹肌后腹（来源于第二鳃弓）
   1. 将头部仰卧位放置于硅胶垫上，并用注射针头固定（图 3A）。
   2. 去除舌下腺和下颌下腺表面的皮下脂肪组织，随后用解剖剪去除浅筋膜及腺体，暴露二腹肌（前腹和后腹）。
   3. 用直镊夹住二腹肌后腹的前侧肌腱，将其切断，并小心解剖至其起始于鼓泡部为止（图 3B）。对侧同样操作。
5. 腭帆提肌（来源于第四鳃弓）
   1. 在解剖完二腹肌后腹后，定位茎舌骨肌，将其向外侧牵拉，并小心将其完全去除（图 4A）。
   2. 定位止于鼓泡部的腭帆提肌肌腱（图 4A），小心解剖并在两侧将其切断。
   3. 寻找气管以及位于其后方的食管，抬起食管以暴露咽部和喉部。
   4. 定位并解剖咽上缩肌区域，辨认腭帆提肌，并在两侧将其切断（图 4B）。
      注意：解剖完成后，立即在体视显微镜下小心去除每块肌肉上的肌腱和结缔组织。迅速将所有标本浸入 70% 乙醇中，随后转移至含 2% P/S 的冰冻 PBS 中，置于 15 ml 离心管内。

3. 卫星细胞（SCs）的分离

1. 进行以下步骤以从三组肌肉中分离SC：
   1. 准备7.5 ml含0.1%蛋白酶（pronase）的DMEM溶液。用0.22 μm滤器过滤该溶液。在分离前，将溶液于37 °C水浴中预热10分钟。
   2. 准备35 ml DMEM培养基，添加10%马血清（HS）和1%青霉素-链霉素（P/S）。同样在水浴中37 °C预热。
   3. 准备15 ml培养液，由DMEM添加20%胎牛血清（FBS）、10% HS、1% P/S和1%鸡胚提取物（CEE）组成。在水浴中37 °C预热。
   4. 用HS预包被六支塑料移液管（10 ml），并在使用前干燥至少10分钟。
2. 在超净工作台中，将每块肌肉转移至6孔板的一个孔内。使用解剖剪刀将肌肉剪切成约2 mm的小块。注意不要过度剪碎组织。
3. 向每个孔中小心加入2.5 ml 0.1% pronase溶液，并在37 °C孵育60分钟。分别在20、40和60分钟时轻轻摇动培养板。
   注意：孵育的确切时间取决于动物的年龄和品系等因素。
4. 在显微镜下观察。检查肌肉碎片，当肌纤维束出现松散时即停止酶消化（图5）。
5. 加入2.5 ml含10% HS和1% P/S的DMEM。转移至15 ml离心管中，以400 × g离心5分钟。通过倾倒弃去上清液。
6. 加入5 ml含10% HS和1% P/S的DMEM。用10 ml塑料移液管反复吹打至少20次（吹打混匀），以均质化组织。
7. 以200 × g离心4分钟。收集上清液并转移至15 ml离心管中。
8. 加入5 ml含10% HS和1% P/S的DMEM。再次用10 ml塑料移液管吹打，直至组织碎片易于通过。
9. 以200 × g离心4分钟，并将上清液收集至15 ml离心管中。
10. 将细胞筛（40 μm）置于50 ml离心管上，将含有解离细胞的上清液转移至滤器中。用1 ml DMEM冲洗滤器，以最大程度回收细胞。
11. 以1,000 × g离心10分钟，用移液器弃去上清液。
12. 用300 μl培养液重悬沉淀，并用血细胞计数板计数细胞。

4. 卫星细胞在细胞外基质凝胶点上的分化

1. 将细胞悬液稀释，以获得含有 1.5 × 10³ 个细胞的 10 μl 培养基。
2. 用胶带固定腔室载玻片的盖子，并在载玻片底面用黑色标记笔标记位置。
3. 使用微量移液器将 10 μl 细胞悬液滴加至细胞外基质胶斑点上。在显微镜下检查细胞悬液滴是否准确置于斑点上。在 37 °C 下孵育 6 小时。
4. 小心加入 400 μl 培养基（DMEM，添加 20% FBS、10% HS、1% P/S 和 1% CEE），在 37 °C 下孵育 3 天。
   注意： 此时，新分离的施万细胞（SC）经历了严重损伤（酶消化和剧烈吹打），需要时间恢复。在最初三天内不要扰动细胞。此后可根据实验类型更换培养基。
   细胞外基质胶斑点可用于高细胞密度接种（1.5–2.5 × 10³/20 μl），用于分化检测。培养基（DMEM，添加 20% FBS、10% HS、1% P/S 和 1% 鸡胚提取物）可每三天更换一次。

结果

图1：载玻片腔室中的细胞外基质凝胶点样。 (A) 为便于操作，将8孔腔室载玻片放入100 mm培养皿中。每孔加入10 μl细胞外基质凝胶，并置于冷表面上（7分钟）。(B) 去除多余细胞外基质凝胶后的腔室载玻片。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
25 G 皮下注射针头 0.5 x 25 m	BD Microlance	300400
解剖剪刀	Braun	BC154R
直头显微镊	Braun	BD330R
外科手术刀片 15 号	Swann-Morton	0205
70% 乙醇	Denteck	2,010,005
Permanox 载玻片，8 孔	Thermo Scientific	177445
6 孔细胞培养板	Greiner bio-one	657160
细胞培养皿（100 x 20 mm）	Greiner bio-one	664160
15 ml 无菌锥形离心管	BD Biosciences	352097
50 ml 无菌锥形离心管	BD Biosciences	352098
细胞滤网（40 μm）	Gibco	431750
10 ml 血清移液管	Greiner bio-one	607180
20 µl FT20	Greiner bio-one	774288
Matrigel，无酚红	BD Biosciences	356237	10 ml
Pronase	Calbiochem	53702	10 KU
磷酸盐缓冲液	Gibco	14190-144	500 ml
DMEM 高糖培养基，含 GlutaMAX 补充剂和丙酮酸钠	Gibco	10569-010	500 ml
胎牛血清	Fisher Scientific	3600511	500 ml
马血清	Gibco	26050088	500 ml
青霉素-链霉素（10,000 U/ml）	Gibco	15140-122	100 ml
鸡胚提取物	MP Biomedicals	2850145	20 ml