维甲酸诱导小鼠胚胎癌细胞神经发生

摘要

来源：Leszczyński, P., 等，  利用 P19 胚胎癌细胞进行神经发生研究 J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了一种利用视黄酸诱导 P19 小鼠胚胎癌细胞神经分化的简单技术。视黄酸可激活转录因子，并启动神经元分化相关的基因表达。

方案

1. 聚集体的制备

1. 向10 mL分化培养基中加入5 µL RA（视黄酸）（1 mM 储存液，溶于99.8%乙醇，-20 °C保存），充分混匀（RA终浓度为0.5 µM）。
   注意：RA对光敏感。低浓度乙醇不影响细胞分化。
2. 将10 mL含RA的分化培养基加入100 mm未经处理的培养皿中（专用于悬浮培养）。
3. 将1 × 10⁶个细胞接种至100 mm培养皿中（培养皿表面积为56.5 cm²）。
4. 将含细胞的培养皿置于37 °C、5% CO₂的培养箱中培养2天，以促进细胞聚集体形成。
5. 2天后，更换分化培养基。用10 mL移液器吸取含有细胞聚集体的培养基，转移至15 mL离心管中，室温放置。
6. 室温下静置1.5分钟，使细胞聚集体依靠重力自然沉降。
7. 弃去上清液。
8. 用10 mL血清移液器加入10 mL新鲜的含0.5 µM RA的分化培养基。
   注意：切勿反复吹打细胞聚集体。
9. 将细胞聚集体接种至新的100 mm未经处理的培养皿中（专用于悬浮培养）。
10. 将培养皿置于培养箱中（37 °C，5% CO₂）继续培养2天。

2. 聚集体解离

1. 使用 10 mL 移液器吸弃细胞聚集体。
2. 将聚集体转移至 15 mL 离心管中，静置 1.5 分钟，使细胞聚集体依靠重力自然沉降。
3. 移除上清液。
4. 用不含血清和抗生素的 DMEM 洗涤聚集体。
5. 在室温下静置 1.5 分钟，使细胞聚集体通过重力沉降。
6. 吸弃上清液，加入 2 mL 胰蛋白酶-EDTA（0.25%）。
7. 将细胞聚集体放入 37 °C 水浴中孵育 10 分钟，每隔 2 分钟用手轻轻敲击混匀。
8. 加入 4 mL 维持培养基以终止消化反应。
9. 使用 1 mL 移液器将聚集体上下吹打 20 次。
10. 在室温下以 200 × g 离心 5 分钟。
11. 移除上清液，并将细胞沉淀重悬于 5 mL 维持培养基中。
12. 使用细胞计数仪测定细胞数量。

3. 细胞接种

1. 在6孔板中每孔加入3 mL维持培养基。
2. 以0.5 × 10⁶/孔的密度将细胞接种至6孔培养板中。
3. 在37 °C、5% CO₂浓度条件下培养。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
高糖DMEM（4.5 g/L），含L-谷氨酰胺	Lonza	BE12-604Q
99.8%乙醇	Chempur	CHEM*613964202
胎牛血清（FBS）	EURx	E5050-03
青霉素/链霉素（10K/10K）	Lonza	DE17-602E
磷酸盐缓冲液（PBS），1×浓度，不含钙离子和镁离子	Lonza	BE17- 517Q
维甲酸	Sigma- Aldrich	R2625-50MG	溶于99.8%乙醇中；-20 °C保存，最长6个月
0.25%胰蛋白酶-EDTA HBSS溶液，不含钙离子和镁离子，含酚红	Biosera	LM-T1720/500
1 mL 移液管	Profilab	515.01
10 mL 移液管	Profilab	515.1
专用于悬浮培养的100 mm培养皿	Corning	C351029
15 mL 离心管	Sigma- Aldrich	CLS430791-500EA
5 mL 移液管	Profilab	515.05
6孔板	Corning	CLS3516
细胞培养瓶，表面积25 cm²	Sigma- Aldrich	CLS430639-200EA