利用视黄酸将类胚体细胞诱导分化为神经前体细胞

摘要

来源：Yang, J., 等 视黄酸诱导小鼠胚胎干细胞在二维和三维胚状体中的神经分化分析。J. Vis. Exp. (2017)。

该视频展示了利用视黄酸和悬滴培养法诱导干细胞分化为神经前体细胞的方法。

方案

1. 小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的培养

1. 配制MEF培养基：杜氏改良伊格尔培养基（DMEM，高糖型），添加15%胎牛血清（FBS）。
2. 在室温下用0.5%明胶溶液对100 mm细胞培养皿包被30分钟。
3. 使用细胞计数仪对MEF细胞进行计数。吸除明胶溶液后，立即加入预热至37 °C的MEF培养基。将经丝裂霉素C处理的MEF冻存管在37 °C水浴中快速解冻2分钟，然后每100 mm明胶包被培养皿接种2.8 × 10⁶个MEF细胞。若使用其他规格培养皿，需相应调整接种细胞数量。将MEF细胞置于37 °C、5% CO₂条件下培养过夜。
4. 次日更换培养基。继续培养2–3天，直至MEF细胞层达到完全汇合。

2. 小鼠胚胎干细胞（ESC）培养

1. 准备 ESC 培养基：在 Iscove 改良的 Dulbecco 培养基（IMDM）中添加 15% 胎牛血清（FBS）、10³ U/mL 白血病抑制因子（LIF）、0.1 mM 非必需氨基酸、55 mM 2-巯基乙醇、青霉素（100 U/mL）、链霉素（100 µg/mL）、庆大霉素（200 µg/mL）以及 0.2% 支原体抗生素。
2. 移除第 1 步中准备的培养皿中的 MEF 培养基，替换为 37 °C 预热的 ESC 培养基。
3. 解冻一管 ESC，将细胞接种至 MEF 层上方。在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养，直至 ESC 达到汇合状态。
4. 准备新的细胞培养皿，其中含有汇合的 MEF 单层细胞。传代 ESC 时，用 PBS 洗涤一次，并加入 0.25% 胰蛋白酶/EDTA，在 37 °C、5% CO₂ 条件下消化 2–5 分钟。加入含 15% FBS 的新鲜 IMDM 以终止消化反应，将细胞悬液转移至 15 mL 离心管中，在室温下以 160 × g 离心 5 分钟。
5. 弃去上清液，用新鲜 IMDM 重悬 ESC，将细胞总量的五分之一接种至每个新的 MEF 包被培养皿中；继续培养至细胞汇合（通常为 4–5 天）。

3. 去除MEFs并在明胶包被的培养板上培养ESC

1. 当 ESCs 达到汇合状态时，用 0.25% 胰蛋白酶/EDTA 按步骤 2.4 的方法将其与 MEFs 分离，用新鲜 IMDM 培养基重悬细胞，转移至非黏附性细菌培养皿中，并在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 40 分钟。
2. 使用 5 mL 移液器小心地将含有 ESCs 和 MEFs 的培养基转移至新的明胶包被的培养板中，避免反复吹打。由于 ESCs 不黏附，留在培养皿中的细胞即为 MEFs。
3. 每 3–4 天传代一次 ESCs。传代频率过低可能会降低 ESCs 的多能性。汇合度不得超过 60%，否则可能促进分化。
4. 根据需要重复步骤 3.2–3.3 至少三次或更多次，直至在细胞培养显微镜下（使用 20X 物镜）无法检测到 MEFs，以确保 MEFs 已完全去除。
5. 通过观察 ESC 培养物是否形成具有典型 ESC 多边形形态的致密克隆来验证其多能性（图 1A）。通过定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）、免疫印迹或核心多能性转录因子的免疫荧光检测来评估细胞的干性（图 2）。

4. 胚状体形成

1. 用DMSO配制10 mM的全反式维甲酸（all-trans-RA）储备液，并分装至1.5 mL避光微量离心管中。该溶液在-80 °C下可稳定保存最多两周。注意避光。
2. 按照步骤2.4的方法对ESCs进行胰酶消化，并以单细胞悬液形式重铺于不含LIF的新鲜IMDM培养基中。
3. 使用血细胞计数板计数细胞，并用含0.5 µM RA的IMDM培养基制备成5 × 10⁵ 个细胞/mL的细胞悬液。
4. 使用八通道移液器和200 µL吸头，每100 mm培养皿中接种100个20 µL的液滴，将培养皿倒置，并在倒置的皿盖中加入PBS以防止悬滴干燥。含RA的培养基需避光处理。
5. 将拟胚体（EBs）在37 °C、5% CO₂条件下以悬滴法培养4天。

结果

图 1： Syx^+/+ 和 Syx^-/- 胚状体（EB）在三维培养中的出芽形成。（A）在诱导神经分化前，Syx^+/+ 和 Syx^-/- 胚胎干细胞（ESC）以集落形式生长。（B 和 C）将拟胚体在悬滴中形成后，加入 0.5 µM 视黄酸（RA）处理，随后转移至不含 RA 的三维胶原基质中。图像于第 6 天拍摄，使用指定倍数的物镜（比例尺：A 和 C 中为 100 µm，B 中为 200 µm）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
材料
MEFs	EMD Millipore	PMEF-CF	ESC 饲养层
ESC	EMD Millipore	CMTI-2
细胞培养皿（60 mm）	Eppendorf	30701119	细胞培养
细胞培养皿（100 mm）	Falcon	353003	细胞培养
培养皿（100 mm）	Corning	351029	悬滴法
深色 1.5 ml 离心管	Celltreat Scientific Products	229437	RA 储存液
显微镜盖玻片	Fisherbrand	12-545-80	圆形，直径 12 mm
Superfrost-plus 显微镜载玻片	Fisherbrand	12-550-15
试剂
DMEM	Lonza	12-709F	MEFs 培养
IMDM	Gibco	12440-046	ESCs 培养
胎牛血清（FBS）	EMD Millipore	ES-009-B	ESCs 培养
明胶	Sigma-Aldrich	G2625	器皿包被
LIF	R&D Systems	8878-LF-025	维持 ESC 多能性
MEM 非必需氨基酸溶液	Gibco	11140050	细胞培养
2-巯基乙醇	Gibco	21985023	细胞培养
青霉素-链霉素	Gibco	15140122	细胞培养
庆大霉素	Gibco	15750060	细胞培养
MycoZap Plus-PR	Lonza	VZA-2022	细胞培养
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25200-072	细胞培养
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
全反式维甲酸	Sigma-Aldrich	R2625-50MG	诱导神经分化
PBS	Gibco	10010049
仪器
宽场显微镜	Nikon	Eclipse TS100	细胞培养成像