少突胶质前体细胞体外转导诱导髓鞘化检测方法

摘要

来源：Peckham, H. M., 等. 慢病毒的制备及其用于选择性转导原代少突胶质前体细胞 体外 髓鞘化检测 视频实验杂志 (2015).

该视频展示了一种将少突胶质前体细胞（OPCs）分化为少突胶质细胞，并在与背根神经节（DRG）神经元共培养体系中诱导髓鞘形成的实验方案。OPCs通过编码调控髓鞘形成的信号蛋白的慢病毒载体进行转导。转导后的OPCs与DRG神经元共培养，以评估其向少突胶质细胞的分化情况以及信号蛋白诱导的髓鞘形成能力。

方案

1. 2K7 慢病毒载体的克隆

1. 在将目的基因克隆至2K7慢病毒载体之前，先使用标准分子生物学技术将该基因亚克隆至pENTR载体（3637 bp，卡那霉素抗性）中。亚克隆时使用EcoRI和SacII限制性酶切位点。
2. 2K7 慢病毒载体的扩增
   1. 将100 ng质粒DNA与感受态细胞轻柔混匀，冰上孵育30 min，以转化2K7慢病毒载体DNA。
   2. 将热激后的DNA/感受态细胞混合物在42 °C下孵育90秒，然后涂布于含有氨苄青霉素（100 µg/ml）和氯霉素（15 µg/ml）的LB琼脂平板上，在37 °C下培养16–18小时。
      ​注意： 氯霉素用于防止长末端重复序列之间的重组。
   3. 第二天，在含有氨苄青霉素（100 µg/ml）和氯霉素（15 µg/ml）的LB（Luria-Bertani）培养基中，于37 °C培养所选的细菌克隆16–18小时。按照生产商说明书，使用商品化的质粒DNA大提试剂盒提取DNA。
3. 从pENTR载体亚克隆至2K7慢病毒载体（图1).
   1. 向一个1.5 ml离心管中加入以下组分并轻轻混匀：L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV（启动子）（60 ng/µl）1–2.5 µl，L1-L2 pENTR4-IRES2GFP（含目的基因）（80 ng/µl）1–2.5 µl，K7慢病毒载体（80 ng/µl）1 µl，TE缓冲液，pH 8，2–5 µl。总体积为8 µl。
   2. 从-80 °C取出克隆酶混合液，在冰上解冻2分钟。确保使用从-80 °C新鲜分装的酶，因为该酶经多次冻融循环后克隆效率会显著降低。
   3. 每反应加入 2 µl 酶，充分混匀 通过 涡旋混匀，并在23-25 °C下孵育连接反应体系6-24小时。
   4. 向克隆酶反应混合物中加入 1 µl 蛋白酶 K 溶液（随酶试剂盒提供），在 37 °C 下孵育 10 分钟。
   5. 将Clonase反应混合物转化至感受态细胞中，并在含有氨苄青霉素（100 µg/ml）的LB培养基中于37 °C培养16–18小时，筛选阳性菌落。
   6. 使用商品化的质粒DNA小量提取试剂盒，按照制造商说明书提取和纯化DNA。
   7. 确认 DNA 通过 使用限制性内切酶 Spe I 和 Sac II 及相应的缓冲液，按照制造商说明书进行消化，以去除含有启动子和目的基因的片段。
      ​注意： 此步骤对于验证亚克隆的DNA是否含有正确的目的插入基因以及正确的载体骨架至关重要。不含插入片段的载体本身大小为6.7 kb。释放出的插入片段大小包括启动子和目的插入基因。请根据特定基因计算酶切后预期的片段大小。 通过 DNA序列编辑软件，例如APE-A Plasmid Editor。
   8. 通过在1×TAE缓冲液中进行1%琼脂糖凝胶电泳，检测DNA载体骨架和释放片段的大小见表1 在100 V下。
   9. 在含有氨苄青霉素（100 µg/ml）的500 ml LB培养基中，于37 °C培养细菌16–18小时，以扩增已确认的DNA。
   10. 使用商品化的质粒DNA大提试剂盒，按照制造商说明书提取和纯化DNA。
       注意： Maxiprep 通常能够获得病毒生产所需的足量 DNA。
4. 重复 步骤 1.3.9–1.3.10 扩增以下用于慢病毒制备的DNA：包膜载体（PMD2.G，6.1 kb）、包装载体（pBR8.91，12.5 kb）以及作为空白对照的空载慢病毒载体（GFP-CMV-2K7，8.7 kb）。

2. 2K7 病毒的制备

注意： 第1天：

1. 转染当天，将3200万个人胚胎肾（HEK）293T细胞接种于一个含有25 ml HEK293T细胞培养基（见表1）的T175培养瓶中。若转染当天时间紧张，可于转染前一天接种1600万细胞。
   注意： 转染当天或提前一天接种细胞均可获得同样成功的转染效果。无论采用哪种方式，关键在于确保细胞在转染前已牢固贴附于培养皿表面。
   注意： 第2天：
2. 转染
   1. 转染前，将DNA用去离子水配制的含10 mM Tris（pH 8）、1 mM EDTA（pH 8）的Tris-乙二胺四乙酸（TE）缓冲液稀释至1 µg/µl。
   2. 在50 ml离心管中，配制总反应混合液（表2)用于T175培养瓶中的转染。将DNA加入预热的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，涡旋充分混匀，然后加入无菌的聚乙烯亚胺（PEI）（见表1，以避免过早沉淀。
   3. 上下颠倒试管3-4次，充分混匀，在室温（RT）孵育15分钟。
   4. 对HEK293T细胞进行完全换液。彻底吸除细胞培养液，并加入预热的HEK293T细胞培养基（每T175培养瓶25 ml）。
   5. 将转染混合物（DNA/PEI 混合物）逐滴加入单层细胞中，轻轻晃动以充分混匀，于 37 °C、5% CO2 条件下孵育过夜。
      ​注意： 第3天：
   6. 为确保转染成功，应在转染后24小时检测绿色荧光蛋白（GFP）的表达情况 通过 荧光显微镜技术
      注意： 通常，超过50%的细胞表达GFP表明转染效果良好。
      注意： 第4天：
3. 转染后48小时，收集病毒上清液，并更换为新鲜的HEK293 T培养基（每T175培养瓶25 ml）。
   1. 在4 °C条件下，以1,140 x g离心病毒上清液10分钟，以去除上清液中的细胞碎片。将澄清后的上清液转移至50 ml离心管中，并于4 °C保存。
      注意：第5天：
4. 转染后72小时，收集第二批病毒上清液。重复步骤2.3.1，合并48小时和72小时的澄清上清液。
5. 为浓缩病毒，将病毒上清液在 170,000 x g 在4 °C下使用30 ml超速离心管离心90分钟。
6. 弃去上清液，并重复步骤 2.6，直至所有澄清的上清液均已完成离心，此时在离心管底部留下含有病毒及沉淀的 PEI 的（不可见）沉淀物。
7. 为重悬病毒，加入 500 µl SATO 培养基 （见表1） 加入超速离心管中。涡旋振荡30秒，并用移液器吸头刮擦管底，以机械方式松解病毒。重复此步骤6次，以充分重悬病毒沉淀。
8. 将重悬的病毒液收集至微量离心管中，短暂离心以去除不溶性PEI。将上清液通过0.45 µm滤器过滤，以去除蛋白质。
9. 将病毒分装为 20 µl、50 µl 和 100 µl 体积，于 -80 °C 保存。

3. 少突胶质前体细胞的转导

1. 解剖后，在37 °C、8% CO₂条件下，使用SATO培养基（10 ml/10 cm培养皿）培养原代少突胶质前体细胞（OPC），培养基中添加睫状神经营养因子（CNTF，10 ng/ml）、血小板源性生长因子（PDGF，10 ng/ml）、神经营养因子3（NT3，1 ng/ml）和佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯（forskolin，4.2 µg/ml），培养24小时。
2. 完全吸除OPC培养基，更换为新鲜配制的含生长因子的SATO培养基（10 ml）（见步骤3.1上方说明）。
3. 将病毒以最佳浓度加入OPC中，继续培养48小时。

4. 用于髓鞘化共培养的少突胶质前体细胞接种（图2）

1. 为去除少突前体细胞（OPCs），首先用 8 ml Earle's 平衡盐溶液（EBSS）清洗 OPC 培养板两次，然后在 37 °C 下用 5 ml 预热的、以 EBSS 按 1:10 稀释的 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 消化 2 分钟。
2. 用含 30% 胎牛血清（FBS）的 EBSS（5 ml）中和胰蛋白酶，并通过移液将细胞从培养板上吹下。将细胞悬液转移至 15 ml 离心管中，在室温下以 180 × g 离心 15 分钟。
3. 吸除上清液，将细胞沉淀重悬于 1 ml 预热的 SATO 培养基中，随后进行细胞计数。
4. 在接种 OPC 前，彻底吸除背根神经节（DRG）培养板中的培养基。按照先前描述的方法，将 200,000 个 OPC 以滴加方式轻柔地接种到 DRG 神经元上。
   注意： 每张 22 mm 盖玻片上的 OPC 接种总体积必须少于 200 µl。
5. 将培养板置于组织培养超净台中静置 10 分钟，使细胞沉降，期间避免移动培养板，然后每孔轻柔地补加 1 ml 预热的 SATO 培养基。
6. 将剩余的同批 OPC 用含生长因子的 SATO 培养基重新接种（见步骤 6.1），并利用这些同批 OPC 验证目标蛋白的表达情况。
7. 24 小时后，将 SATO 培养基更换为共培养体系培养基（2 ml/孔），该培养基由不含因子的 SATO 培养基与神经基础培养基（neurobasal）按体积比（v/v）混合，并添加 1% B2。共培养体系维持 14 天，每隔 2–3 天更换一次培养基。
8. 通过 Western 印迹分析检测共培养体系中髓鞘蛋白的表达，并使用针对髓鞘碱性蛋白标志物和神经元标志物的抗体进行双重免疫荧光染色，以观察髓鞘化轴突节段的形成。

结果

表1. 储备溶液表。

名称	成分	注意事项
TE 缓冲液，pH 8	10 mM Tris pH 8 1 mM EDTA，pH 8	用去离子水配制。
聚乙烯亚胺（PEI）	1 g/L	用去离子水配制，过滤除菌，储存于 -20 °C。
LB培养基	20 g 胰蛋白胨 10 g 酵母提取物 10 g ...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2K7 慢病毒载体			由 Suter 博士惠赠
5-氟-2′-脱氧尿苷	Sigma-Aldrich	F0503-100mg
氨苄青霉素	Sigma-Aldrich	A9518-5G
B27 - NeuroCul SM1 神经元补充剂	Stem Cell Technologies	5711
BDNF（人源）	Peprotech	PT450021000
生物素（d-生物素）	Sigma-Aldrich	B4639
BSA	Sigma-Aldrich	A4161
氯霉素	Sigma-Aldrich	C0378-100G
CNTF	Peprotech	450-13020
DAKO 荧光封片剂	DAKO	S302380-2
DMEM，高糖，含丙酮酸，不含谷氨酰胺	Life Technologies	10313039
DNase	Sigma-Aldrich	D5025-375KU
DPBS	Life Technologies	14190250
DPBS，含钙、镁	Life Technologies	14040182
EBSS	Life Technologies	14155063
EcoRI-HF	NEB	R3101
启动子和目的基因的入门载体			根据方案 1-2 制备
胎牛血清	Sigma-Aldrich	12003C
毛喉素	Sigma-Aldrich	F6886-50MG
葡萄糖（D-葡萄糖）	Sigma-Aldrich	G7528
甘油	Chem Supply	GL010-500M	参见储备溶液