从小鼠大脑中分离荧光标记的神经元

摘要

来源：Paul, A., 等, 利用手动分选及带绝对计数测序的双轮体外转录法对荧光标记的小鼠神经元进行单细胞RNA测序（DIVA-Seq）。J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了一种从小鼠脑中分离荧光标记神经元的方法。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 荧光标记小鼠神经元的手动分选

1. 使用毛细管拉制仪（参数设置如下：加热温度：508，拉力：blank，速度：blank，时间：blank）将玻璃微毛细管（见材料表）拉制成出口直径为 10–15 µm 的尖端。
2. 使用合适的管路连接件，将一段长度为 120–150 cm 的柔性硅胶管（内径约 0.8 mm）连接至一个 0.2 µm 聚偏二氟乙烯（PVDF）膜注射器滤器和一个双向管路阀。
3. 准备 500 mL 冷却（4 °C）的人工脑脊液（ACSF，表 1），并通过曝气石向其中通入含 5% 二氧化碳的平衡氧气 15 分钟，或直至溶液完全澄清，以实现氧合。
4. 在 150 mL 烧杯中配制 100 mL 含活性阻断剂混合物的 ACSF 溶液 （表 1）。
5. 在 150 mL 烧杯中配制 100 mL 含 1 mg/mL Streptococcus IV 型蛋白酶的 ACSF 溶液 （表 1）。
6. 在 150 mL 烧杯中配制 100 mL 含 1% 胎牛血清（FBS）的 ACSF 溶液，并通过曝气石持续通入含 5% 二氧化碳的平衡氧气进行氧合。
7. 通过使用小剪刀打开安乐死小鼠的颅骨，并用精细镊子取出完整脑组织，避免损伤皮层。
   注意：可根据需要选用任意品系、年龄和性别的小鼠。切勿冷冻脑组织，或对注射过病毒或其他危险/传染性试剂的小鼠进行手动分拣。
8. 在整个切片过程中，将脑组织置于冷却且持续氧合的 ACSF 中，并保持连接曝气石通入含 5% 二氧化碳的平衡氧气。
9. 将脑组织固定于振动切片机夹持器上，切成 300 µm 厚的冠状面或矢状面切片。根据需要收集足够数量的切片，以获得至少约 10–50 个标记细胞，最多可达数百个细胞。将切片置于置于烧杯内的棉网切片架上，使其浸没在氧合的 ACSF 中。
10. 将新鲜切片转移至含有含活性阻断剂 ACSF 的烧杯中，在室温下封闭 15–20 分钟。持续使用曝气石通入氧气。
11. 将切片转移至含有蛋白酶溶液 ACSF 的烧杯中，在室温下进行温和消化：P4-14 阶段动物消化 20–30 分钟，P28-56 阶段动物可延长至 45–60 分钟。持续通入氧气。
12. 将切片重新转移回含有含活性阻断剂 ACSF 的烧杯中，在室温下洗涤 5–10 分钟以去除蛋白酶。持续通入氧气。
13. 将单个切片转移至含有含 1% FBS 的 ACSF 的 100 mm 培养皿中，置于室温下。在荧光解剖显微镜下，显微解剖含有至少 10–50 个细胞（最多数百个）的目标区域和层。可使用一对精细镊子，或在木制手柄（竹签）上安装 22–28 G 注射针头进行显微解剖。
14. 使用巴斯德移液管，将显微解剖所得组织块转移至含有约 0.8 mL 含 1% FBS 的 ACSF 溶液的 2 mL 微离心管中。
15. 在室温下对微离心管中的组织进行吹打解离。通过在明火上滚动，制备三支出口直径依次减小的长颈巴斯德移液管。依次使用每支移液管各吹打约 10 次，从最大直径开始，至最小直径结束。
16. 将解离后的细胞悬液滴加至含有氧合 ACSF 的 100 mm 培养皿中（如需要，培养皿底部可薄层涂布一层厚度约 5 mm、按 1:10 比例稀释的 1% 琼脂或透明硅胶化合物）。置于室温下静置。
17. 静置约 5–7 分钟，待细胞逐渐沉降后，在解剖显微镜下观察 GFP/RFP 信号。
    注意：在明场（BF）下可观察到单个细胞、碎片及小团块。
18. 使用连接柔性硅胶管（内径 0.4–0.8 mm）的毛细移液管（来自步骤 1.1），每次吸取 10–15 个 GFP/RFP 阳性细胞，并将细胞转移至含有新鲜氧合 ACSF 的 100 mm 培养皿中。
19. 用舌头堵住管路阀末端，将毛细管尖端移至目标细胞附近。松开阻塞后利用毛细作用吸入细胞，随即再次堵住管路以防止过多液体进入移液管。在解剖显微镜的荧光光学系统下观察毛细管尖端，轻柔吹气将细胞释放至含有新鲜氧合 ACSF 的 100 mm 培养皿中。目标为总共收集约 100–150 个细胞。
20. 根据碎片情况，重复步骤 1.19 一至两次，将总共约 50–75 个细胞转移至新的 100 mm 培养皿中，确保在明场微分干涉差（DIC）光学下污染物（如碎片）尽可能少。

表1：溶液与缓冲液列表。

缓冲液	项目	浓度	体积 (µL)
样本采集缓冲液	重组核糖核酸酶抑制剂		55
	RCC	1:50K 稀释	110
	无核酸酶水		605
	将上述混合液分装至16个管中（2排8联管，200 µL PCR管），每管43.75 µL；每管加入以下试剂
	UMI引物（例如 N10B1-N10B16）	1 ng/µL	6.25  µL/管
	每管终体积为50 µL（每管可再分装为25 µL等份，于-80 °C冻存）
溶液：	项目	浓度	用量
CSF：配制5 L	NaCl	126 mM	36.8 g
	KCl	3 mM	1.15 g
	NaH2PO4	1.25 mM	0.75 g
	NaHCO3	20 mM	8.4 g
	向500 mL ACSF中通氧10–15分钟，每次使用前新鲜加入以下成分：
	D-葡萄糖	20 mM	1.8 g
	MgSO4	2 mM	0.5 mL（来自4 M储备液）
	CaCl2	2 mM	0.5 mL（来自4 M储备液）
	全程保持ACSF处于充氧状态
溶液：	项目	浓度
活性阻断剂混合液：配制100倍储备液
	向100 mL ACSF中加入
	APV	0.05 mM
	CNQX	0.02 mM
	TTX	0.0001 mM（0.1 µM）
溶液：	项目	用量
蛋白酶溶液（100 mL）	灰色链霉菌来源的蛋白酶	100 mg
胎牛血清：商业来源，每次使用前分装为500 µL等份。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DL-AP5	Tocris	Cat# 0105
CNQX	Tocris	Cat# 1045
TTX	Tocris	Cat# 1078
Streptomyces griseus蛋白酶	Sigma-Aldrich	Cat# P5147
碳酰气（Carbogen）	Airgas	Cat# UN3156
Sylgard 184	Sigma-Aldrich	Cat# 761036
配备荧光和明场照明及微分干涉（DIC）光学系统的解剖显微镜（Leica型号MZ-16F）	Leica	型号 MZ-16F
玻璃微毛细管：硼硅酸盐毛细管，500支/包，外径=1 mm，内径=0.58 mm，壁厚=0.21 mm，长度=150 mm	Warner Instruments	型号 GC100-15，订单号# 30-0017
毛细管移液器拉制仪	Sutter Instruments Co	P-97
振动切片机	Thermo Microm	HM 650V
振动切片机组织冷却装置	Thermo Microm	CU 65