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所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。
1. 荧光标记小鼠神经元的手动分选
- 使用毛细管拉制仪（参数设置如下：加热温度：508，拉力：blank，速度：blank，时间：blank）将玻璃微毛细管（见材料表）拉制成出口直径为 10–15 µm 的尖端。
- 使用合适的管路连接件，将一段长度为 120–150 cm 的柔性硅胶管（内径约 0.8 mm）连接至一个 0.2 µm 聚偏二氟乙烯（PVDF）膜注射器滤器和一个双向管路阀。
- 准备 500 mL 冷却（4 °C）的人工脑脊液（ACSF，表 1），并通过曝气石向其中通入含 5% 二氧化碳的平衡氧气 15 分钟，或直至溶液完全澄清，以实现氧合。
- 在 150 mL 烧杯中配制 100 mL 含活性阻断剂混合物的 ACSF 溶液 （表 1）。
- 在 150 mL 烧杯中配制 100 mL 含 1 mg/mL Streptococcus IV 型蛋白酶的 ACSF 溶液 （表 1）。
- 在 150 mL 烧杯中配制 100 mL 含 1% 胎牛血清（FBS）的 ACSF 溶液，并通过曝气石持续通入含 5% 二氧化碳的平衡氧气进行氧合。
- 通过使用小剪刀打开安乐死小鼠的颅骨，并用精细镊子取出完整脑组织，避免损伤皮层。
注意：可根据需要选用任意品系、年龄和性别的小鼠。切勿冷冻脑组织，或对注射过病毒或其他危险/传染性试剂的小鼠进行手动分拣。
- 在整个切片过程中，将脑组织置于冷却且持续氧合的 ACSF 中，并保持连接曝气石通入含 5% 二氧化碳的平衡氧气。
- 将脑组织固定于振动切片机夹持器上，切成 300 µm 厚的冠状面或矢状面切片。根据需要收集足够数量的切片，以获得至少约 10–50 个标记细胞，最多可达数百个细胞。将切片置于置于烧杯内的棉网切片架上，使其浸没在氧合的 ACSF 中。
- 将新鲜切片转移至含有含活性阻断剂 ACSF 的烧杯中，在室温下封闭 15–20 分钟。持续使用曝气石通入氧气。
- 将切片转移至含有蛋白酶溶液 ACSF 的烧杯中，在室温下进行温和消化：P4-14 阶段动物消化 20–30 分钟，P28-56 阶段动物可延长至 45–60 分钟。持续通入氧气。
- 将切片重新转移回含有含活性阻断剂 ACSF 的烧杯中，在室温下洗涤 5–10 分钟以去除蛋白酶。持续通入氧气。
- 将单个切片转移至含有含 1% FBS 的 ACSF 的 100 mm 培养皿中，置于室温下。在荧光解剖显微镜下，显微解剖含有至少 10–50 个细胞（最多数百个）的目标区域和层。可使用一对精细镊子，或在木制手柄（竹签）上安装 22–28 G 注射针头进行显微解剖。
- 使用巴斯德移液管，将显微解剖所得组织块转移至含有约 0.8 mL 含 1% FBS 的 ACSF 溶液的 2 mL 微离心管中。
- 在室温下对微离心管中的组织进行吹打解离。通过在明火上滚动，制备三支出口直径依次减小的长颈巴斯德移液管。依次使用每支移液管各吹打约 10 次，从最大直径开始，至最小直径结束。
- 将解离后的细胞悬液滴加至含有氧合 ACSF 的 100 mm 培养皿中（如需要，培养皿底部可薄层涂布一层厚度约 5 mm、按 1:10 比例稀释的 1% 琼脂或透明硅胶化合物）。置于室温下静置。
- 静置约 5–7 分钟，待细胞逐渐沉降后，在解剖显微镜下观察 GFP/RFP 信号。
注意：在明场（BF）下可观察到单个细胞、碎片及小团块。
- 使用连接柔性硅胶管（内径 0.4–0.8 mm）的毛细移液管（来自步骤 1.1），每次吸取 10–15 个 GFP/RFP 阳性细胞，并将细胞转移至含有新鲜氧合 ACSF 的 100 mm 培养皿中。
- 用舌头堵住管路阀末端，将毛细管尖端移至目标细胞附近。松开阻塞后利用毛细作用吸入细胞，随即再次堵住管路以防止过多液体进入移液管。在解剖显微镜的荧光光学系统下观察毛细管尖端，轻柔吹气将细胞释放至含有新鲜氧合 ACSF 的 100 mm 培养皿中。目标为总共收集约 100–150 个细胞。
- 根据碎片情况，重复步骤 1.19 一至两次，将总共约 50–75 个细胞转移至新的 100 mm 培养皿中，确保在明场微分干涉差（DIC）光学下污染物（如碎片）尽可能少。
表1：溶液与缓冲液列表。
| 缓冲液 | 项目 | 浓度 | 体积 (µL) |
| 样本采集缓冲液 | 重组核糖核酸酶抑制剂 | | 55 |
| RCC | 1:50K 稀释 | 110 |
| 无核酸酶水 | | 605 |
| 将上述混合液分装至16个管中（2排8联管，200 µL PCR管），每管43.75 µL；每管加入以下试剂 |
| UMI引物（例如 N10B1-N10B16） | 1 ng/µL | 6.25 µL/管 |
| 每管终体积为50 µL（每管可再分装为25 µL等份，于-80 °C冻存） |
| 溶液： | 项目 | 浓度 | 用量 |
| CSF：配制5 L | NaCl | 126 mM | 36.8 g |
| KCl | 3 mM | 1.15 g |
| NaH2PO4 | 1.25 mM | 0.75 g |
| NaHCO3 | 20 mM | 8.4 g |
| 向500 mL ACSF中通氧10–15分钟，每次使用前新鲜加入以下成分： |
| D-葡萄糖 | 20 mM | 1.8 g |
| MgSO4 | 2 mM | 0.5 mL（来自4 M储备液） |
| CaCl2 | 2 mM | 0.5 mL（来自4 M储备液） |
| 全程保持ACSF处于充氧状态 |
| 溶液： | 项目 | 浓度 |
| 活性阻断剂混合液：配制100倍储备液 |
| 向100 mL ACSF中加入 | | |
| APV | 0.05 mM | |
| CNQX | 0.02 mM | |
| TTX | 0.0001 mM（0.1 µM） |
| 溶液： | 项目 | 用量 | |
| 蛋白酶溶液（100 mL） | 灰色链霉菌来源的蛋白酶 | 100 mg | |
| 胎牛血清：商业来源，每次使用前分装为500 µL等份。 |