一种生成少突胶质细胞条件培养基的方法

Abstract

来源:Mazuir， E. 等人。用于共培养实验的少突胶质细胞和少突胶质细胞条件培养基的生成。J. Vis. Exp.（2020 年）

该视频演示了通过对少突胶质细胞系细胞进行应激以增强其分子释放到培养基中，从而从少突胶质细胞谱系细胞中生产少突胶质细胞条件培养基 （OCM）。这种培养基富含生长因子、细胞因子和其他生物活性分子，可以添加到神经元培养物中，以深入了解少突胶质细胞分泌因子对神经元生理学和连接性的影响。

Protocol

1. OL 谱系 （OL） 细胞收获和培养

注意:这些步骤应在无菌条件下在层流罩中进行。

1. 摇动后的第二天，根据表 1 准备 Bottenstein-Sato （BS） 培养基。
2. 用无菌蒸馏水冲洗涂有培养皿的培养皿 3 次。
3. 收获烧瓶的上清液，主要含有OL谱系细胞，但也含有一些小胶质细胞，并将其接种在未包被的100 mm培养皿上><。 注意:此步骤允许通过培养皿表面的差异快速粘附去除小胶质细胞。
4. 将培养皿在 37 °C 的加湿培养箱中，在 5% CO₂ 下孵育 15 分钟。
5. 在每个 T150 培养瓶中加入 25 mL 新鲜制备的温热培养基，并在 37 °C 的加湿培养箱中，在 5% CO₂ 下孵育，直至第二次振荡。
6. 将上清液从培养皿转移到新的未包被的 100 mm 培养皿中，以允许残留的小胶质细胞粘附。
7. 将培养皿在 37 °C 的加湿培养箱中，在 5% CO₂ 下孵育 15 分钟。
8. 去除含有非贴壁 OL 谱系细胞的上清液，并将其转移到 50 mL 试管中（50 mL 试管的上清液来自 2 个培养皿）。丢弃铺有小胶质细胞的培养皿。
9. 将上清液以 423 x g 离心 5 分钟。小心去除上清液，并用 1 mL BS 培养基重悬细胞沉淀。将所有沉淀物汇集在一个共同的 50 mL 试管中，并使用 BS 培养基将体积调节至 10 mL。
10. 通过在显微镜下计数细胞来确定细胞密度。
    注意: 细胞密度应介于 3 x 10⁵ 个细胞/mL 和 5 x 10⁵ 个细胞/mL 之间。
11. 如果细胞密度高于或等于 4 x 10⁵ 个细胞/mL，则添加 20 mL BS 以获得 30 mL 的最终体积，如果细胞密度小于 4 x 10⁵ 个细胞/mL，则仅添加 10 mL BS 以获得 20 mL 的最终体积。
12. 用 10 mL 细胞悬液接种 2 个或 3 个预包被的 100 mm 培养皿。在 37 °C 的加湿培养箱中，在 5% CO₂ 下孵育。
13. 2 小时后刷新所有 BS 培养基，清除培养皿中的碎屑><。 注意: 清除前后在显微镜下检查培养物，以验证细胞密度和碎片去除效率。
14. 在 BS 培养基中，在 37 °C 的加湿培养箱中，在 5% CO₂.
    中孵育 2 天 注意:在显微镜下检查培养物。汇合度应为 70% 至 80%。

2. OCM 生产

注意:在无菌条件下，在层流罩中执行这些步骤。

1. 根据表 2 制备 NB-B27low 培养基。
2. 用 10 mL 温热的 NB-B27low 培养基更新培养基。在 37 °C 的加湿培养箱中，在 5% CO₂ 下孵育 2 天。
3. 收获 OCM，即含有 OL 分泌因子的上清液。使用 0.22 μm 过滤器对 OCM 进行过滤消毒。
   注意:将 OCM 在 4 °C 下储存最多 2 个月。

表 1:Bottenstein-Sato （BS） 培养基的制备。

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> Bottenstein-Sato （BS） 媒体 最终浓度 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 青霉素-链霉素 100 国际单位/毫升 载脂蛋白-人转铁蛋白 100 微克/毫升 BSA（牛血清白蛋白） 100 微克/毫升 胰岛素 5 微克/毫升 PDGF 10 纳克/毫升 孕酮 62 纳克/毫升 Putresamine disalt_化工百科 16 微克/毫升 亚硒酸钠 40 纳克/毫升 T3（3,3'，5-三碘-L-甲状腺原氨酸钠盐） 30 纳克/毫升 T4（L-甲状腺素） 40 纳克/毫升

表 2:NB-B27low 和 NB-B27 介质的制备。

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> NB-B27 低介质 最终浓度 Neurobasal B27 补充剂 0.5 倍 L-谷氨酰胺 0.5 毫米 青霉素-链霉素 100 国际单位/毫升 NB-B27 媒体 最终浓度 Neurobasal B27 补充剂 1 倍 L-谷氨酰胺 0.5 毫米 青霉素-链霉素 100 国际单位/毫升

Materials