一种生成少突胶质细胞条件培养基的方法

摘要

来源：Mazuir, E.，等。少突胶质细胞及其条件培养基的制备用于共培养实验。J. Vis. Exp. (2020)

本视频展示了通过施加刺激以促进少突胶质细胞系细胞释放分子，从而制备少突胶质细胞条件培养基（OCM）的方法。该培养基富含生长因子、细胞因子及其他生物活性分子，可添加至神经元培养体系中，用于研究少突胶质细胞分泌因子对神经元生理功能及连接性的影响。

方案

1. 少突胶质细胞系（OL）细胞的收获与培养

注意：这些步骤应在层流罩内的无菌条件下进行。

1. 摇床振荡后的第二天，根据表1配制Bottenstein-Sato（BS）培养基。
2. 用无菌蒸馏水将包被的培养皿清洗3次。
3. 收集含有主要为少突胶质细胞系细胞以及部分小胶质细胞的培养瓶上清液，并将其接种至未包被的100 mm培养皿中。
   注意：此步骤可通过小胶质细胞在培养皿表面差异性快速贴壁的特性将其去除。
4. 将培养皿置于37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中孵育15分钟。
5. 向每个T150培养瓶中加入25 mL温热的新鲜配制的培养基，并在37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中孵育，直至进行第二次摇床振荡。
6. 将培养皿中的上清液转移至新的未包被的100 mm培养皿中，以使残留的小胶质细胞进一步贴壁。
7. 将培养皿置于37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中孵育15分钟。
8. 移除含有非贴壁的少突胶质细胞系细胞的上清液，并将其转移至50 mL离心管中（每2个培养皿的上清液合并至1个50 mL离心管）。弃去接种了小胶质细胞的培养皿。
9. 将上清液在423 × g条件下离心5分钟。小心吸除上清液，用1 mL BS培养基重悬细胞沉淀。将所有细胞沉淀汇集至一个共同的50 mL离心管中，并用BS培养基调整总体积至10 mL。
10. 在显微镜下计数细胞以确定细胞密度。
    注意：细胞密度应达到3 × 10⁵ 个细胞/mL 至 5 × 10⁵ 个细胞/mL。
11. 若细胞密度大于或等于4 × 10⁵ 个细胞/mL，则加入20 mL BS培养基，使终体积为30 mL；若细胞密度小于4 × 10⁵ 个细胞/mL，则仅加入10 mL BS培养基，使终体积为20 mL。
12. 将10 mL细胞悬液接种至两到三个预先包被的100 mm培养皿中。置于37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中孵育。
13. 2小时后更换全部BS培养基以清除碎片。
    注意：在清除碎片前后均应在显微镜下观察培养物，以确认细胞密度及碎片清除效率。
14. 在BS培养基中于37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中继续孵育2天。
    注意：在显微镜下观察培养物，细胞融合度应达到70%至80%。

2. OCM 的制备

注意：在层流罩内的无菌条件下进行这些步骤。

1. 根据表2配制NB-B27low培养基。
2. 用10 mL预热的NB-B27low培养基更换培养液，在37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中培养2天。
3. 收集OCM，即含有少突胶质细胞分泌因子的上清液。使用0.22 µm滤器过滤除菌。
   注意：OCM可在4 °C保存最多2个月。

表1：Bottenstein-Sato（BS）培养基的配制。

Bottenstein-Sato (BS) 培养基	终浓度
Dulbecco 改良 Eagle 培养基
青霉素-链霉素	100 IU/mL
人脱铁转铁蛋白（apo-Transferrin human）	100 µg/mL
牛血清白蛋白（BSA, Bovine Serum Albumin）	100 µg/mL
胰岛素	5 µg/mL
血小板源性生长因子（PDGF）	10 ng/mL
孕酮	62 ng/mL
盐酸亚精胺（Putrescine dihydrochloride）	16 µg/mL
亚硒酸钠	40 ng/mL
三碘甲腺原氨酸钠盐（T3, 3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt）	30 ng/mL
甲状腺素（T4, L-Thyroxine）	40 ng/mL

表2：NB-B27low 和 NB-B27 培养基的配制。

NB-B27 低浓度培养基	终浓度
Neurobasal
B27 补充剂	0.5x
L-谷氨酰胺	0.5 mM
青霉素-链霉素	100 IU/mL
NB-B27 培养基	终浓度
Neurobasal
B27 补充剂	1x
L-谷氨酰胺	0.5 mM
青霉素-链霉素	100 IU/mL

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
B27 添加剂	ThermoFisher	17504044
D-(+)-葡萄糖溶液	Sigma	G8769
DMEM培养基（Dulbecco改良Eagle培养基）	ThermoFisher	31966021
100% 乙醇	Sigma	32221-M
70% 乙醇	VWR Chemicals	83801.36
胎牛血清	ThermoFisher	10082147
Neurobasal 培养基	ThermoFisher	21103049
青霉素-链霉素	ThermoFisher	15140122
不含钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS）	ThermoFisher	A1285601
聚乙烯亚胺（PEI）	Sigma	P3143
Bottenstein-Sato (BS) 培养基
人脱铁转铁蛋白（apo-Transferrin human）	Sigma	T1147
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma	A4161
DMEM培养基（Dulbecco改良Eagle培养基）	ThermoFisher	31966021
胰岛素	Sigma	I5500
血小板源性生长因子（PDGF）	Peprotech	AF-100-13A
青霉素-链霉素	ThermoFisher	15140122
孕酮	Sigma	P8783
盐酸亚精胺（Putrescine dihydrochloride）	Sigma	P5780
亚硒酸钠	Sigma	S5261
T3（3,3',5-三碘-L-甲状腺原氨酸钠盐）	Sigma	T6397
T4（L-甲状腺素）	Sigma	T1775
工具
0.22 µm 滤器	Sartorius	514-7010
1 mL 注射器	Terumo	1611127
100 mm 培养皿	Dutscher	193100
15 mL 离心管	Corning Life Science	734-1867
50 mL 离心管	Corning Life Science	734-1869
60 mm 培养皿	Dutscher	67003