神经元细胞培养用胶原涂层分隔培养皿的制备

摘要

来源：Zepecki, J. P.，等. 在背根神经节轴突-少突胶质细胞共培养物上实时监测人胶质瘤细胞迁移。J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了如何使用胶原蛋白和非反应性润滑脂构建三室细胞培养系统。该系统用于实时观察胶质瘤细胞与轴突之间的相互作用。

方案

1. 大鼠背根神经节（DRGs）、少突胶质前体细胞（OPCs）和 hGCs（人胶质瘤细胞）的区室化培养

1. 分隔式培养皿的制备

注意：在计划收获背根神经节（DRGs）前的数天内执行以下步骤。

1. 组装隔室化培养皿。
2. 将胶原蛋白储备液用无菌蒸馏水稀释至 500 µg/mL₂O；充分混匀。
3. 使用无菌移液管，向一个35 mm培养皿中加入2 mL胶原蛋白溶液；随后吸出溶液，留下一层薄薄的胶原膜，并将该培养皿放入下一个35 mm培养皿中。重复此操作，根据需要添加更多胶原蛋白溶液，直至所有培养皿均完成包被。
4. 所有培养板包被完成后，将培养板放入245 mm × 245 mm的培养托盘中，并在托盘中央放置三块1 mm × 1 mm的纱布垫。
5. 用1 mL浓氨水润湿纱布垫，覆盖在托盘上，使胶原聚合15分钟。
6. 移除纱布垫，并将35 mm培养皿置于超净工作台中晾干。
7. 在培养皿晾干的同时，将高真空润滑脂装入注射器式润滑脂涂抹器的筒内。将带分隔室的腔体放入盛有蒸馏水的广口培养基瓶中。两者均通过高压灭菌法灭菌，随后冷却。
8. 将18号针头的尖端磨钝。在70%乙醇中灭菌。将针头连接至润滑注射器。
9. 将齿耙浸入70%乙醇中消毒，并在超净工作台内自然晾干。
10. 从一个干燥的、包被有胶原蛋白的 35 mm 培养皿中移去盖子。用拇指和食指夹住培养皿。另一只手握住针耙。施加稳定压力，在培养皿中央划出宽度均匀为 200 µM 的划痕。
11. 使用移液管，在划痕中央加入两滴补充神经元基础培养基。
12. 重复步骤 1.1.10–1.1.11，直至所有培养皿均完成划痕。
13. 在层流罩中干燥分隔的腔室。
14. 使用无菌止血钳夹住分隔室中央的隔板。翻转止血钳，使分隔室底部朝上。
15. 在分隔室的顶部开始涂抹硅脂，确保硅脂涂抹整齐，并在所有角落处相互重叠。
16. 从35 mm培养皿上取下盖子。将培养皿倒置，使划痕对准腔室。用一对镊子轻轻敲击培养皿底部。
17. 用止血钳轻轻将培养板翻转过来，然后松开止血钳。
18. 在中心隔室的底部放置一小堆硅脂。向每个腔室加入补充神经元基础培养基（NB），并检查是否泄漏。根据需要使用硅脂密封泄漏处。
19. 继续组装所有培养皿，并在37°C、5% CO₂条件下孵育过夜₂.

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞培养皿	康宁	430165	35 mm × 10 mm
皮下注射针头，18G	BD	511097
氨水溶液	Fisher Scientific	A669-500	浓缩的
细胞培养皿	康宁	430165
坎彭诺特室	Tyler Research	CAMP-10
止血钳	Roboz	RS-7035
Cultrex 大鼠 I 型胶原蛋白	Trevigen	3440-100-01
针梳	泰勒研究	CAMP-PR
Neurobasal 培养基	赛默飞世尔科技	21103049
硅脂
金属锉刀
托盘
纱布
CO2 培养箱
玻璃移液管