从鸡胚中分离颅部神经褶以培养神经嵴细胞

摘要

来源：Jacques-Fricke, B. T.，等。鸡颅神经嵴细胞培养物的制备与形态学分析。J. Vis. Exp. (2022)。

本视频展示了一种从鸡胚中脑区域分离颅神经褶的技术。该方法详细介绍了神经褶的解剖过程，以及如何将其放置并附着于纤维连接蛋白包被的盖玻片上，随后观察神经褶中神经嵴细胞的迁移过程。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 溶液与材料的准备

1. 通过混合 123.3 mM NaCl、1.53 mM CaCl₂、4.96 mM KCl、0.809 mM Na₂HPO₄ 和 0.147 mM KH₂PO₄ 配制林格氏液（见材料表）。调节 pH 至 7.4，并过滤除菌至 100 mL 瓶中。存放于洁净干燥处。切勿用肥皂清洗瓶子（按组织培养玻璃器皿处理）。
2. 将纤连蛋白（FN）溶于无菌林格氏液中，配制成 1 mg/mL 的储存液（见材料表），分装为 100 µL 每份，于 -80 °C 保存（至少可稳定保存 4 年）。
3. 通过在 L15 培养基中添加 0.8% L-谷氨酰胺、0.08% 青霉素/链霉素、10% 胎牛血清（FBS）和 10% 鸡胚提取物，配制完全培养基。分装为 3 mL 每份，于 -20 °C 或 -80 °C 保存。
   注意：若培养物需在 CO₂ 培养箱中孵育，则需用 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 F12（DMEM/F12）替代 L15，因为 L15 是为空气环境缓冲设计的。
4. 制备滤纸支撑架（约 1 cm × 1.5 cm 的矩形滤纸片，沿长轴方向打两个或三个重叠的孔）。
   1. 使用标准三孔打孔器在大片滤纸上沿边缘打孔，将打孔边缘裁剪成条状，再在孔之间切割成约 1.5 cm 长的矩形。使用前对滤纸进行高压灭菌（可选）。
5. 准备解剖工具，包括精细镊子（#5）、钝头镊子、解剖剪、弹簧剪和磨尖的钨针。

2. 培养皿的制备

1. 选择适合下游应用的神经褶培养皿（参见材料表）。
   1. 对于需要固定和染色的培养，将玻璃盖玻片放入多孔组织培养板中使用。
      注意：与孔大小匹配的盖玻片在液体混合时移动较少，可减少外植体移位，并使其更易贴附于盖玻片而非培养皿底部。
   2. 对于使用倒置显微镜进行活体成像，选择玻璃底单腔或分隔腔培养皿（参见材料表）。
   3. 对于在直立式或体视显微镜上进行活体成像，使用光学性能合适的6孔、12孔或24孔组织培养板。
   4. 对于大量收集迁移性神经嵴细胞以进行高通量分析，选择塑料组织培养皿。
2. 向100 mL无菌林格氏液中加入10 U/mL青霉素和10 μg/mL链霉素（例如，加入100 μL浓度为10,000 U/mL的青霉素和10,000 μg/mL的链霉素），配制林格氏P/S液。林格氏P/S液需在1周内使用完毕。
3. 将一份1 mg/mL的FN溶液置于冰上解冻，用林格氏P/S液稀释至终浓度为10–100 μg/mL的FN溶液。
4. 用移液器加入足量FN溶液以覆盖孔或培养皿底部。例如，24孔板每孔加100 μL，35 mm培养皿加500 μL。
5. 盖上盖子，在解剖神经褶期间，将含FN溶液的培养皿或培养板置于湿润培养箱（或装有经蒸馏水浸湿的纸巾的加盖托盘）中，于38 °C（100 °F）孵育至少1小时。

3. 解剖神经褶

1. 将胚胎转移至含有Ringer's P/S溶液的洁净培养皿中，用镊子夹住滤纸框，轻轻前后晃动，以洗去遮挡胚胎视野的卵黄。若溶液变浑浊，应更换Ringer's P/S溶液或将胚胎转移至新的培养皿中。
2. 在解剖显微镜下将胚胎背侧/滤纸框朝上放置。保持胚胎附着在滤纸框上，以使其保持拉紧并固定，用镊子去除卵黄膜，暴露神经褶。
   注意：若胚胎从滤纸框上脱落，可将其平铺于培养皿中，或用针固定在涂有硅胶（sylgard）的培养皿中进行解剖。
3. 使用弹簧剪刀或锋利的钨针，小心切除中脑神经褶。应包括视泡扩张部位后方、后脑前方的组织，此处菱脑节（rhombomere）的缩窄结构刚开始出现（心形区也是一个有用的解剖标志，图1B, C）。切除时应注意尽可能保留神经褶最背侧的部分，并尽量减少神经管及非神经外胚层的污染（图1C）。
4. 使用P20移液器或经含卵黄的Ringer's P/S溶液冲洗过的无菌玻璃巴斯德吸管，将神经褶转移至含有Ringer's P/S溶液的洁净培养皿中（该处理可阻断塑料或玻璃表面，防止组织粘附）。在继续解剖其他神经褶期间，将已收集的组织置于冰上保存。

4. 接种神经褶

1. 解冻一份完全培养基（第1节，第3步）。加入100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素，并过滤除菌。在进行其他步骤时，将配制好的培养基保持在37-38 °C。
2. 从培养箱中取出培养皿（第2节，第5步）。使用移液器或巴斯德吸管，从盖玻片、培养皿或孔板中移除FN溶液。用Ringer's P/S冲洗FN包被的基质后，向培养皿或孔板中加入适量完全培养基（24孔板每孔500 µL，35 mm培养皿或6孔板每孔2 mL）。
   注意：较小体积可节省昂贵的试剂（例如，24孔板可低至200 µL），但需确保培养皿内湿度足够，以避免蒸发。
3. 使用p20或p200移液器时，首先用含卵黄的Ringer's P/S冲洗移液枪头，以封闭塑料表面并防止组织粘连。然后，将分离的神经褶转移至FN包被的盖玻片上，注意尽可能少地带入Ringer's P/S。将神经褶置于FN包被盖玻片的中央位置。
   注意：可在19 mm孔内的12 mm盖玻片上接种一个或少数几个神经褶，35 mm培养皿上最多可接种50个。
4. 让外植块静置10-15分钟后，缓慢而小心地将接种有神经褶的培养皿放入38 °C（100 °F）的湿化培养室中。此举可最大限度减少孔板内神经褶的移动，确保其保持分散状态并附着于盖玻片上。
   注意：若使用L15（非DMEM），外植块培养皿也可置于孵蛋培养箱中，采用加盖托盘并垫湿润纸巾的方式进行培养。
5. 将神经褶培养物置于湿化培养箱中孵育，持续至活跃迁移阶段结束（约总共16-20小时，图2）。

结果

图 1. 鸡胚背侧神经褶的解剖。在 Ringer's P/S 溶液中操作，使用弹簧剪切除神经褶。(A) 胚胎背侧观，图中上方为头端。神经褶比周围组织更不透明。中脑神经褶位于视叶（粉红色）的后方和心月（黄色）的前方。(B) 去除神经褶后胚胎的背侧视图，显示切除边界。(C) 去除神经褶后胚胎的侧视图。该解剖技术可去除背侧神经管，避免损伤腹侧及非神经管结构。(D) 在 Ringer's P/S 溶液中分离的神经褶。比例尺 = 300 μm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
配备由 ZEN 3.0 SR 软件控制的 LSM710 共聚焦扫描头的 AxioObserver 显微镜	Zeiss		使用 alpha Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC M27 物镜
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3306
培养皿（玻璃底，单室或分隔式）	MatTek; Cell Vis	P35G-1.5-14-C (MatTek) X000NOJQGX (Cellvis) X000NOK1OJ (Cellvis)	单室 35 mm 或 4 室 35 mm
盖玻片	Carolina Biological Supply Company	633029, 633031, 633033, 633035, 633037	圆形，厚度 0.13–0.17 mm，直径可选 12–25 mm
DMEM/F12	ThermoFisher Scientific	11320033	L15 培养基的替代品
孵蛋器	Sportsman	1502
FBS	Life Technologies	10437-028
纤连蛋白	Fisher Scientific	CB-40008A
滤纸	Whatman		3MM 层析级
镊子（钝头）	Fisher Scientific; Thomas Scientific	08-890 (Fisher);1141W97 (Thomas)
镊子（精细）	Fine Science Tools	11252-20	Dumont #5
针夹	Fine Science Tools	26016-12	用于钨针（弹簧剪刀的替代品）
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P0662
L15 培养基	Invitrogen	11415064
L-谷氨酰胺	Invitrogen	25030
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S9638
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
青霉素/链霉素	Life Technologies	15140-148	青霉素 10,000 单位/mL；链霉素 10,000 mg/mL
培养皿	VWR (或同类产品)		60 mm，100 mm
剪刀（解剖用）	Fine Science Tools	14061-10
弹簧剪刀	Fine Science Tools	15000-08	2.5 mm 刃口（钨针的替代品）
Sylgard	Krayden	Sylgard 184
注射器滤器	Sigma-Aldrich	SLGVM33RS	Millex-GV 注射器滤器，0.22 µm，PVDF 材质，33 mm，经伽马射线灭菌
组织培养皿	Sarstedt	83-3900	用于大量神经褶培养的 35 mm 培养皿
钨丝	多种来源		直径 0.01"，用于制作钨针（弹簧剪刀的替代品）