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从小鼠内耳分离前庭神经节神经元

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2025年7月8日

本文内容

摘要

来源：Iyer, M. R. 等，从新生啮齿类动物分离并培养前庭和螺旋神经节胞体用于膜片钳记录 J. Vis. Exp. (2023)。

本视频展示了一种从小鼠幼崽内耳中分离前庭神经元的方法。该方法详细阐述了内耳解剖、前庭神经节采集以及将神经节解离为单个细胞的各个步骤。随后，将这些细胞培养在玻璃底培养皿中，以建立前庭神经元培养体系。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 准备工作

注意：本节所述的溶液和工具可提前制备，并在解剖和记录当天使用。

  1. 制备添加了 10 mM HEPES 的 Liebovitz 培养基（L-15 溶液）。以下步骤描述了如何配制 1 L 的 L-15 溶液。
    1. 将 990 mL 去离子 H2O 倒入一个烧杯中。称取并加入 2.386 g（10 mM）HEPES。加入一瓶 1 L 装的 L-15 溶液粉末。
      ​注意： 粉末状 L-15 保质期更长，且占用更少的储存空间。也可选择购买预配制的 L-15 溶液，并自行添加 HEPES。后一种方案还可选用不含酚红的溶液，适用于荧光成像。
    2. 将溶液置于磁力搅拌器上搅拌。使用 pH 计，缓慢加入 1 N 氢氧化钠（NaOH），使 pH 值调节至 7.34 至 7.36 之间。
    3. 加入去离子 H2O，直至溶液总体积达到 1,000 mL。使用孔径为 0.22 µm 的滤膜过滤溶液。
      注意： L-15 溶液可在 4 °C 下保存 1–2 周。若使用含酚红的 L-15 溶液，当溶液过碱性时（pH > 7.4）会变为粉红色，过酸性时（pH < 7.34）则变为橙色。
  2. 制备前庭神经节神经元（VGNs）的培养基。按以下步骤配制 50 mL 培养基：
    1. 将 47.5 mL GluMAX-I 最低必需培养基加入洁净的玻璃烧杯中。
    2. 称取并加入 0.1194 g（10 mM）HEPES。该额外缓冲剂可在细胞转移至培养箱前沉降过程中抵抗 pH 变化。
    3. 加入 2.5 mL 胎牛血清（FBS）。最终培养基总体积为 50 mL，FBS 体积分数为 5%。
    4. 将溶液置于磁力搅拌器上搅拌。使用 pH 计，缓慢加入 1 N NaOH，使 pH 值调节至 7.38 至 7.4 之间。
    5. 加入 0.5 mL 青霉素-链霉素溶液。通过 0.22 µm 无菌滤器过滤溶液。将配制好的培养基储存于 4 °C。
    6. 使用前至少 30 分钟，将培养基转移至带有透气盖的组织培养瓶中。将装有培养基的培养瓶置于含 5% CO2 、温度为 37 °C 的培养箱中平衡。

2. 制备 triturating 移液管

注意：研磨移液管可重复用于多个实验。每次使用前，用乙醇、水和L-15溶液冲洗移液管；每次使用后，用水和乙醇清洗，并在存放期间小心保存。

  1. 为制备用于细胞解离的吹打移液管，将一根玻璃巴斯德移液管置于本生灯火焰上。当玻璃尖端开始熔化时，将玻璃拉伸至所需的尖端直径。将移液管一端从火焰中拉出，形成一个小弯折。
  2. 将弯曲的移液管靠近显微镜。使用刻痕板在所需直径处进行划痕并折断玻璃。
  3. 将移液管尖端快速通过本生灯火焰顶部，以迅速熔光尖端附近的粗糙边缘。检查确认火焰未将尖端完全封闭。
  4. 重复此过程，直至制备出四到五根不同口径的移液管。

3. 前庭神经节的提取与前庭神经元的接种

  1. 解剖前准备
    1. 配制含有 0.05% 胶原酶和 0.25% 胰蛋白酶的 L-15 溶液酶混合液。例如，将 0.001 g 胶原酶和 0.005 g 胰蛋白酶加入 2 mL L-15 溶液中，置于烧杯内，放入小型磁力搅拌子，搅拌至完全溶解，室温下备用。
    2. 准备市售的断头器，在断头器侧面和下方放置纸巾，以减少血液及其他生物材料对实验台面和其他表面的污染。
    3. 摆放大号不锈钢剪刀、大号镊子和大号弹簧剪刀。准备一个装有 70% 乙醇的大喷瓶，用于清洁头部。
    4. 用 100 mL 烧杯盛装 L-15 溶液并置于冰上。对 L-15 溶液进行氧合处理。
    5. 摆放弹簧剪刀、手术剪刀、镊子、解剖刀和移液管（参见 材料表）。
    6. 准备一个 60 mm 培养皿（用于粗解剖）和两个 35 mm 培养皿（用于神经节的清洗/精细解剖）。使用带 0.22 µm 滤嘴的 30 mL 注射器将氧合后的 L-15 溶液注入 60 mm 培养皿中。
  2. 安乐死、头部清洁与半头切开
    1. 称量幼鼠体重，计算应腹腔注射的致死剂量稀释液用量（约每 10 g 体重注射 0.01 mL）。
    2. 当通过脚趾夹捏无反应判断已达到深度麻醉状态后，使用断头器进行断头。
    3. 用 70% 乙醇彻底冲洗头部，随后再用 L-15 溶液彻底冲洗。
    4. 完全去除颅骨上的皮肤。使用大号弹簧剪刀从脊髓进入脑部的位置开始，将头部沿中线切开：第一刀切开颅顶，第二刀切开下颌底部。最后使用手术剪刀完成头部的完全切分。
    5. 将头部的两半脑面朝下放入盛有 L-15 溶液的 60 mm 培养皿中。未立即进行解剖的新鲜组织应置于冰上保存。
  3. 提取上 vestibular 神经节
    1. 用闭合的手术剪刀挖出脑组织。切断并移除脑神经，使脑组织完全与颅骨分离。
      注意： 此时应在头部后方观察到耳囊（形状类似数字 8）。
    2. 使用镊子从头部后方开始，剥离透明的膜状组织。
    3. 用手术剪刀剪除颅顶部分。去除头部后方和颈部多余的组织，使解剖区域和耳囊更清晰、更易于操作。
      注意： 操作过程中应及时丢弃多余组织，避免培养皿内液体变得浑浊。
    4. 将组织转移至另一个盛有新鲜 L-15 溶液的培养皿中。定位耳囊以及听神经、上 vestibular 神经和下 vestibular 神经。剪除听神经，并使用小型弹簧剪刀分离上 vestibular 和下 vestibular 神经节。
      注意： 尽管前庭神经的胞体分布于下（较细）和上（较粗）两个神经节中，但从上神经节提取的细胞存活率更高。
    5. 使用解剖刀轻轻刮除骨性嵴，以削弱神经进入骨性囊之前所经过的骨质区域。用精细镊子小心清除碎屑，充分暴露神经节的整个膨大部分。
    6. 使用精细弹簧剪刀切断并分离朝向椭圆囊方向延伸的周围神经分支与神经节的连接。
    7. 用精细镊子取出上 vestibular 神经节，注意避免夹持部位过于靠近神经节组织。将其转移至盛有新鲜 L-15 溶液的 35 mm 培养皿中。
    8. 在继续下一步操作前，预热酶溶液：将酶混合液倒入 35 mm 培养皿中，置于 37 °C 培养箱中孵育 10–15 分钟。
    9. 使用精细镊子和小型弹簧剪刀清理神经节，去除呈白色结晶状结构的骨组织、多余组织、神经纤维及其他无关结构。注意尽量减少对神经节组织本身的损伤。
  4. 组织解离与接种
    1. 将清理后的神经节转移至预热的酶溶液中，重新放入培养箱孵育 10 至 40 分钟。当组织开始松散但仍保持整体结构时，即表示酶解完成。若酶处理时间过长，会导致神经节在吹打前完全溶解。
      ​注意： 酶处理时间取决于动物的年龄。例如，P9 大鼠的神经节酶处理时间为 25 分钟，P15 大鼠的神经节酶处理时间为 35 分钟。
    2. 将神经节转移至盛有新鲜 L-15 溶液的 35 mm 培养皿中，孵育 2–3 分钟。
    3. 将神经节转移至另一个盛有过滤培养基的 35 mm 培养皿中。
    4. 使用 200 µL 微量移液器，将约 150 µL 过滤后的培养基滴加到包被过的玻璃底培养皿上。不要加入过多溶液，必须保持表面张力，使液滴在盖玻片上方形成稳定的液泡。
    5. 将所需数量的神经节（1 至 4 个）转移至盖玻片上。
    6. 从培养皿中吸取少量培养基，用于冲洗吹打移液管，防止组织粘附在玻璃移液管壁上。通过轻柔且反复地吹打组织，使其充分解离。
      注意： 不要过度吹打以追求单细胞悬液，也不要施加过大的正压导致细胞迅速沉降至培养皿底部。同时应避免产生气泡，否则会降低细胞存活率。轻柔吹打是确保细胞高存活率的关键。
    7. 让细胞静置 5 分钟。在光学显微镜下观察细胞是否已沉降到盖玻片表面。
    8. 小心将培养皿放入 37 °C 培养箱中培养 12–24 小时。再次确认液泡保持完整。
      注意： 若培养时间超过 24 小时，需每日更换培养基。此步骤可作为可能的暂停点。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
B27添加剂（50倍浓缩，无血清）赛默飞世尔科技17504044培养基添加剂，用于螺旋神经节神经元
烧杯（1000、100、10）毫升
台式离心机USA Scientific2641-0016
本生灯
胶原酶Sigma-AldrichC5318消化组织所用的三种酶之一
盖玻片，矩形，1号厚度，22×40 Warner Instruments64-0707
DMSOBiotium90082
牛胰脱氧核糖核酸酶 ISigma-Aldrich11284932001消化组织的三种酶之一
Dumont #3 镊子（钝头）Fine Science Tools11231-30
Dumont #5 镊子（精细型）Fine Science Tools11251-10
Dumont #55 镊子（精细型）Fine Science Tools11255-20
乙醇Decon Labs2716用于清洁头部及解剖台周围区域
用于电极的细丝状硼硅酸盐毛细管Sutter InstrumentsBF140-117-10
精细刃口解剖刀Fine Science Tools10010-00
玻璃巴斯德吸管VWR14673-010用于拉制移液毛细管
热灭活胎牛血清赛默飞世尔科技16140063培养基添加剂
HEPESSigma-AldrichH3375-100G用于pH缓冲的本方案中所有溶液
加热板/磁力搅拌器 VWR76549-914
装有冰的保温桶保持所有样品和溶液处于低温状态
大型弹簧剪Fine Science Tools14133-13
Leibovitz培养基 Sigma AldrichL4386灌流液与浸泡液 
用于培养皿的低剖面浴式记录室Warner Instruments64-0236
30 ml 鲁尔锁注射器BD302832用于吸取L-15/HEPES/HEPES溶液。
MEM + 谷氨酰胺补充剂Fisher Scientific41-090-101培养基底部
用于填充微移液管的microFil针头 - 34号规格 World Precision InstrumentsMF34G
N2 补充剂（100 倍）赛默飞世尔科技17502-048添加至培养基，用于螺旋神经节神经元
NaOH (1 M)Thomas Scientific319511-500ML用于滴定 pH
医用级氧气，配备合适的减压阀和管路南加州大学物资管理MEDOX200（编号：00015）用于溶解于解剖液和灌流液中
Parafilm贝米斯PM992
巴斯德吸管胶头（3 ml）Fisher Scientific03-448-25用于吹打移液管的吹吸头
青霉素/链霉素赛默飞世尔科技15140122防止培养基污染的添加剂
基于戊巴比妥的安乐死溶液（例如，Fatal Plus，剂量为 50–60 mg/kg） MWI动物健康15199用于安乐死
PES 膜过滤器  0.2 微米 Nalgene566-0020用于过滤溶液
PES 膜无菌注射器滤器，0.22 μm，30 mm CELLTREAT229747用于过滤吸入注射器的溶液
培养皿，35 × 10 毫米Genessee Scientific32-103用于显微解剖及在穿孔膜片钳构型中盛放尖端浸蘸溶液
培养皿，60 × 15 mmMidland ScientificP7455用于大体解剖
pH计Mettler ToledoModel S20
移液器（1000、200、10）微升USA Scientific
聚-D-赖氨酸包被的玻璃底培养皿MattekP35GC-0-10-C用于神经元培养的接种
快速换液平台，带加热底座，适用于35 mm培养皿Warner Instruments64-0375
参照细胞世界精密仪器公司RC1T
手术刀片Miltex4-315
手术刀柄Fine Science Tools10003-12
科学天平Mettler ToledoXS64
血清移液管（10，25）毫升Fisher Scientific
硅脂套装（用于密封盖玻片和腔室）Warner Instruments64-0378
小型动物断头器Kent ScientificDCAP
小型动物断头器Kent ScientificDCAP对于解剖 P15 以上大鼠时的断头处理。
体视解剖显微镜 ZeissStemi 2000
直型手术剪Fine Science Tools14060-09
注射器（3、10、30）毫升
胰蛋白酶Sigma AldrichT1426消化组织的三种酶之一
结核菌素注射器 Covidien8881500105通过腹腔注射给予安乐死溶液
Vannas弹簧剪，2.5 mm切割刃Fine Science Tools15000-08
1000毫升容量瓶
涡旋混合VWR945300
水，无菌超纯，R>18.18 兆欧·厘米（例如，经 Millipore-Sigma 水纯化系统过滤）Millipore-SigmaCDUFBI001

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神经节分离组织解剖酶解离机械吹打细胞培养玻璃底培养皿L-15 溶液蛋白水解酶
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