从小鼠内耳分离前庭神经节神经元

摘要

来源：Iyer, M. R. 等，从新生啮齿类动物分离并培养前庭和螺旋神经节胞体用于膜片钳记录 J. Vis. Exp. (2023)。

本视频展示了一种从小鼠幼崽内耳中分离前庭神经元的方法。该方法详细阐述了内耳解剖、前庭神经节采集以及将神经节解离为单个细胞的各个步骤。随后，将这些细胞培养在玻璃底培养皿中，以建立前庭神经元培养体系。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 准备工作

注意：本节所述的溶液和工具可提前制备，并在解剖和记录当天使用。

1. 制备添加了 10 mM HEPES 的 Liebovitz 培养基（L-15 溶液）。以下步骤描述了如何配制 1 L 的 L-15 溶液。
   1. 将 990 mL 去离子 H₂O 倒入一个烧杯中。称取并加入 2.386 g（10 mM）HEPES。加入一瓶 1 L 装的 L-15 溶液粉末。
      ​注意： 粉末状 L-15 保质期更长，且占用更少的储存空间。也可选择购买预配制的 L-15 溶液，并自行添加 HEPES。后一种方案还可选用不含酚红的溶液，适用于荧光成像。
   2. 将溶液置于磁力搅拌器上搅拌。使用 pH 计，缓慢加入 1 N 氢氧化钠（NaOH），使 pH 值调节至 7.34 至 7.36 之间。
   3. 加入去离子 H₂O，直至溶液总体积达到 1,000 mL。使用孔径为 0.22 µm 的滤膜过滤溶液。
      注意： L-15 溶液可在 4 °C 下保存 1–2 周。若使用含酚红的 L-15 溶....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
B27添加剂（50倍浓缩，无血清）	赛默飞世尔科技	17504044	培养基添加剂，用于螺旋神经节神经元
烧杯（1000、100、10）毫升
台式离心机	USA Scientific	2641-0016
本生灯
胶原酶	Sigma-Aldrich	C5318	消化组织所用的三种酶之一
盖玻片，矩形，1号厚度，22×40	Warner Instruments	64-0707
DMSO	Biotium	90082
牛胰脱氧核糖核酸酶 I	Sigma-Aldrich	11284932001	消化组织的三种酶之一
Dumont #3 镊子（钝头）	Fine Science Tools	11231-30
Dumont #5 镊子（精细型）	Fine Science Tools	11251-10
Dumont #55 镊子（精细型）	Fine Science Tools	11255-20
乙醇	Decon Labs	2716	用于清洁头部及解剖台周围区域
用于电极的细丝状硼硅酸盐毛细管	Sutter Instruments	BF140-117-10
精细刃口解剖刀	Fine Science Tools	10010-00
玻璃巴斯德吸管	VWR	14673-010	用于拉制移液毛细管
热灭活胎牛血清	赛默飞世尔科技	16140063	培养基添加剂
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-100G	用于pH缓冲的本方案中所有溶液
加热板/磁力搅拌器	VWR	76549-914
装有冰的保温桶			保持所有样品和溶液处于低温状态
大型弹簧剪	Fine Science Tools	14133-13
Leibovitz培养基	Sigma Aldrich	L4386	灌流液与浸泡液
用于培养皿的低剖面浴式记录室	Warner Instruments	64-0236
30 ml 鲁尔锁注射器	BD	302832	用于吸取L-15/HEPES/HEPES溶液。
MEM + 谷氨酰胺补充剂	Fisher Scientific	41-090-101	培养基底部
用于填充微移液管的microFil针头 - 34号规格	World Precision Instruments	MF34G
N2 补充剂（100 倍）	赛默飞世尔科技	17502-048	添加至培养基，用于螺旋神经节神经元
NaOH (1 M)	Thomas Scientific	319511-500ML	用于滴定 pH
医用级氧气，配备合适的减压阀和管路	南加州大学物资管理	MEDOX200（编号：00015）	用于溶解于解剖液和灌流液中
Parafilm	贝米斯	PM992
巴斯德吸管胶头（3 ml）	Fisher Scientific	03-448-25	用于吹打移液管的吹吸头
青霉素/链霉素	赛默飞世尔科技	15140122	防止培养基污染的添加剂
基于戊巴比妥的安乐死溶液（例如，Fatal Plus，剂量为 50–60 mg/kg）	MWI动物健康	15199	用于安乐死
PES 膜过滤器  0.2 微米	Nalgene	566-0020	用于过滤溶液
PES 膜无菌注射器滤器，0.22 μm，30 mm	CELLTREAT	229747	用于过滤吸入注射器的溶液
培养皿，35 × 10 毫米	Genessee Scientific	32-103	用于显微解剖及在穿孔膜片钳构型中盛放尖端浸蘸溶液
培养皿，60 × 15 mm	Midland Scientific	P7455	用于大体解剖
pH计	Mettler Toledo	Model S20
移液器（1000、200、10）微升	USA Scientific
聚-D-赖氨酸包被的玻璃底培养皿	Mattek	P35GC-0-10-C	用于神经元培养的接种
快速换液平台，带加热底座，适用于35 mm培养皿	Warner Instruments	64-0375
参照细胞	世界精密仪器公司	RC1T
手术刀片	Miltex	4-315
手术刀柄	Fine Science Tools	10003-12
科学天平	Mettler Toledo	XS64
血清移液管（10，25）毫升	Fisher Scientific
硅脂套装（用于密封盖玻片和腔室）	Warner Instruments	64-0378
小型动物断头器	Kent Scientific	DCAP
小型动物断头器	Kent Scientific	DCAP	对于解剖 P15 以上大鼠时的断头处理。
体视解剖显微镜	Zeiss	Stemi 2000
直型手术剪	Fine Science Tools	14060-09
注射器（3、10、30）毫升
胰蛋白酶	Sigma Aldrich	T1426	消化组织的三种酶之一
结核菌素注射器	Covidien	8881500105	通过腹腔注射给予安乐死溶液
Vannas弹簧剪，2.5 mm切割刃	Fine Science Tools	15000-08
1000毫升容量瓶
涡旋混合	VWR	945300
水，无菌超纯，R>18.18 兆欧·厘米（例如，经 Millipore-Sigma 水纯化系统过滤）	Millipore-Sigma	CDUFBI001