从小鼠幼崽脑皮层中分离与培养少突胶质前体细胞

摘要

来源：Sinyuk, M.，等。从小鼠中枢神经系统多个区域分离和提取胶质细胞。J. Vis. Exp. (2020)

本视频演示了一种从小鼠幼崽脑皮层中分离和培养少突胶质细胞前体细胞（OPCs）的技术。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 组织解离

注意：以下所有操作均须在指定的无菌生物安全柜中，采用无菌技术和无菌材料进行。

1. 向每个含有 9 mL DMEM 和组织的 15 mL 圆锥形管中加入 1 mL 含有 0.53 mM EDTA 的 0.05% 胰蛋白酶，以开始组织裂解。
   注意： DMEM 含有较高浓度的氯化钙，可能抑制胰蛋白酶活性。如果按照上述步骤操作后组织仍未完全解离，可使用不含钙和镁的 Hanks 平衡盐溶液替代。胰蛋白酶消化后，可通过添加胰蛋白酶抑制剂中和酶活性；但由于钙是后续步骤中使用的 DNase I 的辅因子，因此应将钙重新加入溶液中。
2. 用 10 mL 移液管吹打约 20 次。
3. 将细胞悬液转移至空的 50 mL 圆锥形管中。
4. 将溶液在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 15 分钟，并在 8 分钟后轻轻振荡裂解物。
5. 向每管中加入 5 mL MGM 和 200 µL（5 mg/mL）DNase I，使终浓度为 50 µg/mL。
6. 用 10 mL 移液管对每份裂解物吹打 10 次。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.05% 胰蛋白酶和 0.53 mM EDTA	Gibco	25300054	组织解离
1X PBS pH 7.4	Gibco	10010031	标准试剂
50 mL，25 cm 方形细胞培养瓶	Greiner Bio-One	690 175	细胞培养（T25）瓶
抗生素-抗真菌剂 100X	Gibco	15240-096	培养基组分
B-27 补充剂 50X	Gibco	17504-044	培养基组分
牛血清白蛋白	Sigma	A9647-50G	抗体稀释液
DMEM（1X），高糖含丙酮酸钠	Gibco	11995040	培养基组分
DNase I	Sigma	10104159001	组织解离
经热灭活的胎牛血清	Gibco	A3840001	培养基组分
Hanks' 平衡盐溶液（不含 Ca 或 Mg）	ThermoFisher	14170120	组织解离
L-谷氨酰胺，200 mM	Gibco	20530081	培养基组分
Neurobasal 培养基	Gibco	21103-049	培养基组分
正常山羊血清	Sigma	G9023	封闭液组分
多聚-D-赖氨酸包被的 12 mm #1 德国玻璃盖玻片	Corning Biocoat	354086	细胞贴附基质