来源：Sinyuk, M.，等。从小鼠中枢神经系统多个区域分离和提取胶质细胞。J. Vis. Exp. (2020)
本视频演示了一种从小鼠幼崽脑皮层中分离和培养少突胶质细胞前体细胞（OPCs）的技术。
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方法文章
从小鼠幼崽脑皮层中分离与培养少突胶质前体细胞
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。
1. 组织解离
注意：以下所有操作均须在指定的无菌生物安全柜中，采用无菌技术和无菌材料进行。
- 向每个含有 9 mL DMEM 和组织的 15 mL 圆锥形管中加入 1 mL 含有 0.53 mM EDTA 的 0.05% 胰蛋白酶，以开始组织裂解。
注意： DMEM 含有较高浓度的氯化钙，可能抑制胰蛋白酶活性。如果按照上述步骤操作后组织仍未完全解离，可使用不含钙和镁的 Hanks 平衡盐溶液替代。胰蛋白酶消化后，可通过添加胰蛋白酶抑制剂中和酶活性；但由于钙是后续步骤中使用的 DNase I 的辅因子，因此应将钙重新加入溶液中。 - 用 10 mL 移液管吹打约 20 次。
- 将细胞悬液转移至空的 50 mL 圆锥形管中。
- 将溶液在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 15 分钟，并在 8 分钟后轻轻振荡裂解物。
- 向每管中加入 5 mL MGM 和 200 µL（5 mg/mL）DNase I，使终浓度为 50 µg/mL。
- 用 10 mL 移液管对每份裂解物吹打 10 次。
- 将细胞悬液在室温下静置 3 分钟，使未解离的组织沉降至管底。
- 将细胞悬液转移至新的 50 mL 圆锥形管中，留下未解离的组织。
注意： 上述裂解和吹打步骤可显著减少未解离组织的残留量。 - 在 4 °C 下以 300 × g 离心 3 分钟，离心时不启用刹车。
- 吸除上清液，并将剩余的细胞沉淀重悬于 5 mL MGM 中。
- 用 5 mL 移液管吹打沉淀 20 次。
- 将 5 mL 细胞悬液接种至包被的 T25 培养瓶中。
- 将细胞在 37 °C、5% CO2 条件下孵育，并在 24 小时后首次更换培养基以去除细胞碎片。
注意： 某些方案建议在 72 小时后进行首次换液。此步骤可能需要优化。 - 每 48–72 小时用 MGM 进行一次完全换液，直至细胞融合度达到 80%（约 5–7 天）。
注意：所有培养基在更换前必须预热至 37 °C。
2. 少突胶质前体细胞的分离
初次分离少突胶质前体细胞（OPC）后进行接种时，必须将其接种于多聚-D-赖氨酸包被的表面（无菌培养板或盖玻片）。请在完成本步骤前准备好上述材料。
- 振荡培养 15 小时后，从烧瓶中移去上清液，并将其接种于无菌的 100 mm 培养皿中。
- 将上清液在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 30 分钟，孵育 15 分钟后轻轻旋转培养皿以去除残留的小胶质细胞，因为这些细胞会迅速贴附于培养皿表面。此步骤可使用未经组织培养处理的培养皿。
- 收集未贴壁的细胞上清液，计数后接种于多聚-D-赖氨酸包被的培养表面。通常接种密度为 7,500–10,000 个少突胶质前体细胞（OPC）/cm2。
- 在 37 °C、5% CO2 条件下孵育至少 1 小时（最长可达 6 小时），然后轻柔吸除 95% 的培养基，缓慢加入预热的 OPC 培养基，加样时将液体沿孔壁缓慢滴加，以尽量减少对 OPC 的扰动。每 48 小时更换一次培养基，直至细胞可用于实验。
注意：每次只能更换一个孔的培养基。OPC 细胞较为敏感，尤其不耐受干燥环境。OPC 培养基中添加 PDGF-AA 的目的是延迟 OPC 向少突胶质细胞的成熟。若实验关注点为成熟的少突胶质细胞，可在培养基中省略该因子。
表1：缓冲液与培养基配方。
混合胶质细胞培养基（MGM）
| 88 mL | 1X DMEM（高糖，含L-谷氨酰胺，含丙酮酸钠） |
| 10 mL | 热灭活胎牛血清（FBS） |
| 1.0 mL | L-谷氨酰胺（100X） |
| 1.0 mL | 抗生素/抗真菌剂 |
OPC 培养基（50 mL）
| 49 mL | Neurobasal 培养基 |
| 1.0 mL | B27 添加剂 (50X) |
| 10 ng/mL | PDGF-AA |
| 注意： PDGF-AA 需在每次换液前新鲜添加。 | |
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.05% 胰蛋白酶和 0.53 mM EDTA | Gibco | 25300054 | 组织解离 |
| 1X PBS pH 7.4 | Gibco | 10010031 | 标准试剂 |
| 50 mL，25 cm 方形细胞培养瓶 | Greiner Bio-One | 690 175 | 细胞培养（T25）瓶 |
| 抗生素-抗真菌剂 100X | Gibco | 15240-096 | 培养基组分 |
| B-27 补充剂 50X | Gibco | 17504-044 | 培养基组分 |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | A9647-50G | 抗体稀释液 |
| DMEM（1X），高糖含丙酮酸钠 | Gibco | 11995040 | 培养基组分 |
| DNase I | Sigma | 10104159001 | 组织解离 |
| 经热灭活的胎牛血清 | Gibco | A3840001 | 培养基组分 |
| Hanks' 平衡盐溶液（不含 Ca 或 Mg） | ThermoFisher | 14170120 | 组织解离 |
| L-谷氨酰胺，200 mM | Gibco | 20530081 | 培养基组分 |
| Neurobasal 培养基 | Gibco | 21103-049 | 培养基组分 |
| 正常山羊血清 | Sigma | G9023 | 封闭液组分 |
| 多聚-D-赖氨酸包被的 12 mm #1 德国玻璃盖玻片 | Corning Biocoat | 354086 | 细胞贴附基质 |
