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所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。
1. 组织解离
注意：以下所有操作均须在指定的无菌生物安全柜中，采用无菌技术和无菌材料进行。
- 向每个含有 9 mL DMEM 和组织的 15 mL 圆锥形管中加入 1 mL 含有 0.53 mM EDTA 的 0.05% 胰蛋白酶，以开始组织裂解。
注意： DMEM 含有较高浓度的氯化钙，可能抑制胰蛋白酶活性。如果按照上述步骤操作后组织仍未完全解离，可使用不含钙和镁的 Hanks 平衡盐溶液替代。胰蛋白酶消化后，可通过添加胰蛋白酶抑制剂中和酶活性；但由于钙是后续步骤中使用的 DNase I 的辅因子，因此应将钙重新加入溶液中。
- 用 10 mL 移液管吹打约 20 次。
- 将细胞悬液转移至空的 50 mL 圆锥形管中。
- 将溶液在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 15 分钟，并在 8 分钟后轻轻振荡裂解物。
- 向每管中加入 5 mL MGM 和 200 µL（5 mg/mL）DNase I，使终浓度为 50 µg/mL。
- 用 10 mL 移液管对每份裂解物吹打 10 次。
- 将细胞悬液在室温下静置 3 分钟，使未解离的组织沉降至管底。
- 将细胞悬液转移至新的 50 mL 圆锥形管中，留下未解离的组织。
注意： 上述裂解和吹打步骤可显著减少未解离组织的残留量。
- 在 4 °C 下以 300 × g 离心 3 分钟，离心时不启用刹车。
- 吸除上清液，并将剩余的细胞沉淀重悬于 5 mL MGM 中。
- 用 5 mL 移液管吹打沉淀 20 次。
- 将 5 mL 细胞悬液接种至包被的 T25 培养瓶中。
- 将细胞在 37 °C、5% CO2 条件下孵育，并在 24 小时后首次更换培养基以去除细胞碎片。
注意： 某些方案建议在 72 小时后进行首次换液。此步骤可能需要优化。
- 每 48–72 小时用 MGM 进行一次完全换液，直至细胞融合度达到 80%（约 5–7 天）。
注意：所有培养基在更换前必须预热至 37 °C。
2. 少突胶质前体细胞的分离
初次分离少突胶质前体细胞（OPC）后进行接种时，必须将其接种于多聚-D-赖氨酸包被的表面（无菌培养板或盖玻片）。请在完成本步骤前准备好上述材料。
- 振荡培养 15 小时后，从烧瓶中移去上清液，并将其接种于无菌的 100 mm 培养皿中。
- 将上清液在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 30 分钟，孵育 15 分钟后轻轻旋转培养皿以去除残留的小胶质细胞，因为这些细胞会迅速贴附于培养皿表面。此步骤可使用未经组织培养处理的培养皿。
- 收集未贴壁的细胞上清液，计数后接种于多聚-D-赖氨酸包被的培养表面。通常接种密度为 7,500–10,000 个少突胶质前体细胞（OPC）/cm2。
- 在 37 °C、5% CO2 条件下孵育至少 1 小时（最长可达 6 小时），然后轻柔吸除 95% 的培养基，缓慢加入预热的 OPC 培养基，加样时将液体沿孔壁缓慢滴加，以尽量减少对 OPC 的扰动。每 48 小时更换一次培养基，直至细胞可用于实验。
注意：每次只能更换一个孔的培养基。OPC 细胞较为敏感，尤其不耐受干燥环境。OPC 培养基中添加 PDGF-AA 的目的是延迟 OPC 向少突胶质细胞的成熟。若实验关注点为成熟的少突胶质细胞，可在培养基中省略该因子。
表1：缓冲液与培养基配方。
混合胶质细胞培养基（MGM）
| 88 mL | 1X DMEM（高糖，含L-谷氨酰胺，含丙酮酸钠） |
| 10 mL | 热灭活胎牛血清（FBS） |
| 1.0 mL | L-谷氨酰胺（100X） |
| 1.0 mL | 抗生素/抗真菌剂 |
OPC 培养基（50 mL）
| 49 mL | Neurobasal 培养基 |
| 1.0 mL | B27 添加剂 (50X) |
| 10 ng/mL | PDGF-AA |
| 注意： PDGF-AA 需在每次换液前新鲜添加。 |