一种从人类胚胎干细胞生成脑类器官的技术

摘要

来源：Boisvert, E. M.，等。一种由人胚胎干细胞生成脑类器官的静态自导向方法。J. Vis. Exp  (2020)。

本视频展示了一种利用人胚胎干细胞（hESCs）生成脑类器官的技术。将贴壁培养的人胚胎干细胞集落用酶处理，使其脱离并解离成细胞簇。这些细胞簇在悬浮培养中形成三维球体，随后被诱导分化为模拟大脑皮层结构的类器官，包含分层的神经元和胶质细胞。

方案

1. 干细胞维持

1. 根据制造商说明，将 H9 hESC 细胞培养在一层生长因子减少的基底膜基质（参见材料表，下文简称为基质）上。
   1. 为包被一个 6 孔板或一个 10 cm 培养皿，将 100 µL 基质与 5.9 mL 冰冷的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）/F12 培养液混合。用封口膜包裹培养板，于 4 °C 过夜保存。次日吸除多余基质/培养液后用于细胞传代。
2. 每周以约 1:12 的分裂比例每 7 天传代一次。使用 mTESR-1 培养基，在 37 °C、低氧培养箱（5% O₂、5% CO₂）中培养细胞。每天更换培养基。在传代期间使用玻璃工具剔除正在分化的细胞。
3. 在用于生成类器官前 4 至 6 天应对 H9 细胞进行传代。细胞应以约 1:8 的细胞簇比例传代。具体操作为：先用 Dulbecco 改良 Eagle 培养基/营养混合物 F-12（DMEM/F12）培养液清洗细胞，再用中性蛋白酶（例如 dispase，下文简称为蛋白酶）消化细胞，随后用 DMEM/F12 清洗，并将 30–60 个细胞簇以约 20% 的融合度接种至 4 个培养板（6 孔板或 10 cm 培养皿）中。收获前两天，将细胞转移至常规培养箱（21% O₂、5% CO₂）。开始形成类器官时，培养板细胞融合度应达到约 80%。

2. 类器官培养中 hESC 的解离

1. 分装蛋白酶储备液（5 U/mL）。
   注意：我们通常将1 mL分装液在-20 °C下冷冻保存，可使用数月。
2. 将蛋白酶储备液稀释至工作浓度：每6孔板或10 cm培养皿的hESC，加入1 mL储备液和5 mL DMEM/F12培养基。
3. 吸除细胞培养液，用蛋白酶溶液覆盖hESC。将培养板放入培养箱中孵育10–15分钟，或直至细胞集落边缘变圆并开始从基质上分离。
4. 倾斜培养板，吸除蛋白酶溶液，并用DMEM/F12培养基轻柔洗涤细胞三次。使用6孔板时，每次洗涤每孔使用2 mL；使用10 cm培养皿时，每次使用6 mL。此步骤中需确保细胞集落仍附着于基质上。
5. 向每孔重新加入约1.5 mL新鲜mTESR培养基（或每10 cm培养皿加入5 mL），并通过轻柔吹打使细胞脱离培养板。
6. 使用10 mL移液器，在培养板内轻柔吸打hESC，直至其大小约为原始尺寸的1/30。完成此步骤后，细胞集落应呈大小约为250–350 µm的方形簇状。

3. 类器官的生成

1. 将细胞转移至一个含有30 mL mTESR培养基（不含碱性成纤维细胞生长因子，bFGF）的超低吸附T75培养瓶中。
2. 次日，倾斜培养瓶，使活细胞聚集于瓶角（第一天可能需要5–10分钟，随着细胞团块增大，聚集速度会加快）。
   注意：若在此步骤或后续任何步骤中发现大量细胞已贴附于培养瓶底部，应将细胞转移至新的培养瓶。前两天出现较高比例的死细胞属正常现象。进行换液时，应尽可能清除细胞碎片。
3. 待细胞沉降后，吸除培养基和死细胞，保留约10 mL含活细胞的培养基。
4. 加入约20 mL低浓度bFGF培养基（DMEM/F12，添加1× N2、1× B27、1× L-谷氨酰胺、1×非必需氨基酸（NEAA）、0.05%牛血清白蛋白（BSA）和0.1 mM单硫代甘油（MTG），并补充30 ng/mL bFGF）。
5. 在第2天观察细胞状态。若大多数细胞形态健康、透亮，则无需处理。但若超过三分之一的细胞呈现暗沉，则需更换培养基（采用与步骤3.2相同的倾斜方法），加入约20 mL补充有20 ng/mL bFGF的低浓度bFGF培养基。
6. 第3天，采用步骤3.2中的倾斜方法，更换一半培养基，加入20 mL补充有10 ng/mL bFGF的低浓度bFGF培养基。
7. 第5天，采用步骤3.2中的倾斜方法，更换一半培养基，加入20 mL神经诱导培养基（NIM：DMEM/F12，1× N2补充剂，0.1 mM MEM NEAA，2 µg/mL肝素）。
   注意：若存在明显大于其他细胞团或类器官的大型团块，应将其从培养体系中移除。大小可通过显微镜下观察评估（例如使用带刻度目镜）。大多数类器官大小相近（约100 ± 20 µm）。我们移除了尺寸约为其他类器官一半或两倍以上的类器官。
8. 每隔一天，采用倾斜法更换约一半（约15 mL）培养基，补充神经诱导培养基（NIM）。
9. 培养3周后，可根据需要向培养基（NIM：DMEM/F12，1× N2补充剂，0.1 mM MEM NEAA，2 µg/mL肝素）中加入100×青霉素/链霉素，使其终浓度为1×。每隔一天更新培养基。
   注意：通过此方法，我们可将类器官在体外培养中维持长达6个月。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
B27 补充剂	Gibco, Waltham, MA, USA	17504-044
bFGF	Life Technologies, Carlsbad, CA, USA	PHG0263
BSA	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	A9647
Dispase	STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada	7913
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	11330-032
DPBS	Gibco, Waltham, MA, USA	10010023
生长因子减少型 Matrigel（基质）	Corning, Corning, NY, USA	356231
H9 hESCs	WiCell, Madison, WI, USA	WA09
肝素	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	9041-08-01
L-谷氨酰胺	Gibco, Waltham, MA, USA	25030-081
巯基甘油	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	M6145
mTESR 培养基	STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada	85850
N2 NeuroPlex	Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA	400-163
NEAA	Gibco, Waltham, MA, USA	11140-050
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T8787-100ML
超低吸附 T75 培养瓶	Corning, Corning, NY, USA	3814