从小鼠胚胎中分离与培养动眼神经、滑车神经及脊髓运动神经元

摘要

Fujiki, R., 等. 从产前Isl^mn:GFP转基因小鼠中分离与培养动眼神经、滑车神经及脊髓运动神经元。J. Vis. Exp. (2019)

该视频展示了从转基因小鼠胚胎中分离动眼神经、滑车神经和脊髓运动神经元的过程。该胚胎的运动神经元表达绿色荧光蛋白（GFP）标记，便于观察和识别。在荧光显微镜下通过手术分离运动神经元，并将其维持在培养基中进行培养。

方案

1. 腹侧中脑与脊髓解剖

注意：除步骤 1.1.1−1.1.3 和 1.1.5−1.1.6 外，其余所有步骤均需在荧光解剖体视显微镜下进行。每次实验的总解剖时间通常为 3−5 小时，具体时长取决于解剖技术的熟练程度以及每个实验所需的运动神经元数量。

1. 腹侧中脑解剖
   1. 使用二氧化碳气体结合颈椎脱位法，处死受孕约11.5天的怀孕小鼠。
   2. 用乙醇彻底喷洒腹部，使用无菌显微解剖剪和有齿镊取出子宫。将子宫在无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中短暂清洗后，转移至盛有预冷无菌PBS的解剖板中。
   3. 在显微镜强光下，于冰上无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中，使用无菌显微解剖剪、有齿镊和Dumont #5镊子小心地从子宫中取出Isl^MN:GFP（胰岛素瘤运动神经元：绿色荧光蛋白）阳性的胚胎。使用无菌Moria微型穿孔勺将每个胚胎转移至24孔板中单独的孔内，每孔预先加入含1× B27的预冷低荧光Hibernate-E培养基。将24孔板置于冰上保存。
   4. 将一个胚胎转移至无菌解剖板，并完全覆盖冰上预冷的无菌Hank's平衡盐溶液（HBSS）。
   5. 确保所有解剖步骤均在显微镜的异硫氰酸荧光素（FITC）照明下进行。使用镊子去除胚胎的尾部和面部，注意不要损伤中脑（图1Ba

结果

表1：解离步骤中使用的木瓜蛋白酶、卵白蛋白-卵黏蛋白抑制剂及终悬浮液的适当体积。 木瓜蛋白酶和卵白蛋白-卵黏蛋白抑制剂的适当体积是根据多次优化实验，对厂家说明书推荐值进行调整后确定的。由于组织在解离和分选过程中易受损伤，建议合并收集超过10个腹侧中脑组织和超过3个腹侧脊髓组织。木瓜蛋白酶的体积需兼顾解离效率与操作对细胞造成的应激反应；卵白蛋白-卵黏蛋白抑制剂溶液的体积为木瓜蛋白酶体积的一半。Hibernate E终悬浮液的适当体积应确保细胞密度不超过10⁷ 个细胞/mL，同时避免细胞过度稀释。

中脑数量 (X)

木瓜蛋白酶

卵白蛋白-卵黏蛋白

Hibernate .......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
B27添加剂（50倍浓缩，无血清）	赛默飞世尔科技	17504-044
BD FACSAria llu SORP 流式细胞仪	BD生物科学	-	该系统配备4个激光器，分别为405 nm、488 nm、594 nm和640 nm。
BD Falcon 70μm 尼龙细胞滤网	CORNING	352350	用于在流式细胞术分选前过滤解离的细胞。
BD Falcon 圆底带盖离心管（带卡扣盖）	CORNING	352054
BDNF 人源	ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd.	CYT-207
细胞培养微孔板，96孔，聚苯乙烯，F型底（烟囱型孔）	Greiner Bio-One 国际公司	655090	我们尝试了多种96孔板，此款在免疫细胞化学检测前的培养和分析中效果最佳
CNTF 人源	ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd.	CYT-272
4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）	赛默飞世尔科技	D1306
二甲基亚砜	Sigma-Aldrich	D2650	DMSO
Dumont #5 镊子，不锈钢尖端，尺寸 0.05 × 0.01 mm，Biologie 尖头	Roboz 外科手术器械	RS-5015
Forskolin	赛默飞世尔科技	BP25205
GDNF 人源	ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd.	CYT-305
GlutaMAX 补充剂	赛默飞世尔科技	35050-061
Hanks' 平衡盐溶液 (HBSS)	赛默飞世尔科技	14175-095
休眠 E	BrainBits	HE
低荧光 E 型休眠液	BrainBits	HELF	应降低会干扰胚胎GFP表达观察的荧光。
马血清，热灭活，新西兰来源	赛默飞世尔科技	26050-070
IBMX	Tocris Cookson	2845	异丁基甲基黄嘌呤
层粘连蛋白	赛默飞世尔科技	23017-015
Leibovitz L15 培养基	赛默飞世尔科技	11415064
2-巯基乙醇	Sigma-Aldrich	M6250
显微解剖剪	Roboz 外科手术器械	RS-5913
Micro Knife 4.75" 1.7 x 27 mm 刀片	Roboz 外科手术器械	RS-6272
Moria 迷你穿孔匙	Fine Science Tools	10370-19
奥林巴斯 1.7 ml 微量离心管，透明	Genesee Scientific	22-281	这些是我们之前描述过的试管 "1.7 mL 微量离心管" 在该背景下。
木瓜蛋白酶解离系统	沃辛顿生化公司	LK003150	使用该试剂盒配制木瓜蛋白酶溶液和白蛋白-卵黏蛋白抑制剂溶液。
青霉素-链霉素（10,000 U/ml）	赛默飞世尔科技	15140-122
磷酸盐缓冲液（PBS）	赛默飞世尔科技	10010-023
聚D-赖氨酸（PDL）	MilliporeSigma	A-003-E
SMZ18 和 SMZ1500 变焦体视显微镜配备 DS-Ri1 相机	尼康	-	解剖操作完成后，在这些荧光显微镜下拍摄解剖后的胚胎和组织图像。
Sylgard 170 黑色硅胶封装材料 - A+B 组分，0.9 公斤装套件	道康宁	1696157	我们使用该试剂盒制备解剖培养皿。
TC处理培养皿，100 × 20 mm	Genesee Scientific	25-202	我们使用这种培养皿制作解剖用培养皿。
桑氏敷料镊 4.5" 锯齿状，2.2 mm 尖端宽度	Roboz 外科手术器械	RS-8100
蔡司LSM 700系列激光扫描共聚焦显微镜及Zen软件	卡尔·蔡司	-	使用以下设备拍摄了胚胎的共聚焦图像