从小鼠胚胎中分离与培养动眼神经、滑车神经及脊髓运动神经元

摘要

Fujiki, R., 等. 从产前Isl^mn:GFP转基因小鼠中分离与培养动眼神经、滑车神经及脊髓运动神经元。J. Vis. Exp. (2019)

该视频展示了从转基因小鼠胚胎中分离动眼神经、滑车神经和脊髓运动神经元的过程。该胚胎的运动神经元表达绿色荧光蛋白（GFP）标记，便于观察和识别。在荧光显微镜下通过手术分离运动神经元，并将其维持在培养基中进行培养。

方案

1. 腹侧中脑与脊髓解剖

注意：除步骤 1.1.1−1.1.3 和 1.1.5−1.1.6 外，其余所有步骤均需在荧光解剖体视显微镜下进行。每次实验的总解剖时间通常为 3−5 小时，具体时长取决于解剖技术的熟练程度以及每个实验所需的运动神经元数量。

1. 腹侧中脑解剖
   1. 使用二氧化碳气体结合颈椎脱位法，处死受孕约11.5天的怀孕小鼠。
   2. 用乙醇彻底喷洒腹部，使用无菌显微解剖剪和有齿镊取出子宫。将子宫在无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中短暂清洗后，转移至盛有预冷无菌PBS的解剖板中。
   3. 在显微镜强光下，于冰上无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中，使用无菌显微解剖剪、有齿镊和Dumont #5镊子小心地从子宫中取出Isl^MN:GFP（胰岛素瘤运动神经元：绿色荧光蛋白）阳性的胚胎。使用无菌Moria微型穿孔勺将每个胚胎转移至24孔板中单独的孔内，每孔预先加入含1× B27的预冷低荧光Hibernate-E培养基。将24孔板置于冰上保存。
   4. 将一个胚胎转移至无菌解剖板，并完全覆盖冰上预冷的无菌Hank's平衡盐溶液（HBSS）。
   5. 确保所有解剖步骤均在显微镜的异硫氰酸荧光素（FITC）照明下进行。使用镊子去除胚胎的尾部和面部，注意不要损伤中脑（图1Ba）。将胚胎腹侧朝下放置，四肢分开于下方，尾部朝向显微镜前方，即操作者方向（以星号标示，图1Bb）。
   6. 使用镊子切开第四脑室顶部，形成一个小开口。利用该开口将镊子插入第四脑室与其顶部之间的空隙。沿胚胎背侧、皮层前方以及底板和运动柱外侧进行解剖（图1Ca,b）。将解剖后的组织以“摊开书本”方式展开，暴露出GFP阳性的动眼神经元（第III对脑神经 [CN3]）和滑车神经元（第IV对脑神经 [CN4]）核团。
      注意：此时将暴露出一块来自腹侧中脑的小组织，其中包含间充质、CN3和CN4。
   7. 使用镊子和显微解剖刀小心地将腹侧中脑从胚胎中分离，并去除脑膜组织。使用镊子和显微解剖刀将双侧GFP阳性的CN3和CN4核团从底板及其他GFP阴性周围组织中分离出来（图1D）。在切除的组织中尽可能保留更多的GFP阳性运动神经元，但避免触碰或损伤这些细胞。
   8. 若需分别收集CN3和CN4核团，可沿这两个核团的中线（图1D中黄色虚线）进行切割。使用P1000移液器吸取尽可能少的HBSS液体，收集解剖所得的腹侧中脑组织，并转移至标记好的盛有解剖培养基的1.7 mL微量离心管中。置于冰上保存，直至进行细胞解离。
   9. 继续将来自其他胚胎的腹侧中脑组织汇集至同一离心管中，直至总数满足实验需求（参见步骤4以获取理想细胞数量）。
      注意：建议至少汇集10个腹侧中脑组织，可获得约1 × 10⁴个CN3/CN4运动神经元，因为组织在解离和分选过程中会受到应激影响。
2. 腹侧脊髓解剖
   1. 将胚胎保持腹侧朝下，头部朝向显微镜前方，即操作者方向。用一对镊子固定胚胎，将另一对镊子的尖端插入未打开的第四脑室尾侧部分。
   2. 沿胚胎全长从头端至尾端方向，背侧打开后脑和脊髓。从第四脑室开始，使用镊子作为剪刀，剪开背侧组织，一直延伸至尾部脊髓的中央管（图1Ca,b）。操作过程中注意避免触碰或损伤腹侧脊髓。
   3. 用一对镊子固定胚胎，用另一对镊子从两侧夹除背侧组织瓣（图1Ea,b）。
      注意：切除的背侧组织包含背侧皮肤、间充质、背根神经节（DRGs）、背侧后脑及脊髓。应尽可能去除这些组织，但不得损伤脊髓运动神经元（SMN）核团，因为这些组织具有黏附性，可能在过滤过程中捕获SMN或导致流式细胞分选（FACS）时堵塞。
   4. 使用显微解剖刀直接在GFP阳性的SMN下方穿刺，通过两侧锯齿状上提动作分离腹侧脊髓（图1Fa,b）。在C1节段上方横向切断漂浮的腹侧脊髓，此处为第一个GFP阳性前角突起的位置（图1G）。同时在下肢上界处进行横向切断（图1G）。完成上述操作后，取出从颈段（C1）至腰段（L2-L3）的腹侧脊髓部分。
   5. 将腹侧脊髓背侧朝上放置，用一对镊子夹住GFP阳性SMN柱之间的GFP阴性组织以固定。使用显微解剖刀修剪GFP阳性SMN柱两侧，去除残留的附着间充质、DRGs和背侧脊髓组织（图1H）。注意在不损伤细胞的前提下尽可能保留GFP阳性运动神经元。
   6. 使用P1000移液器吸取尽可能少的HBSS液体，收集解剖所得的腹侧脊髓组织，并转移至标记为SMN的盛有解剖培养基的1.7 mL微量离心管中。置于冰上保存，直至进行细胞解离。继续将来自其他胚胎的腹侧脊髓组织汇集至同一离心管中，直至总数满足实验需求。
      注意：建议至少收集三个腹侧脊髓组织，可获得约2.1 × 10⁴个SMN，因为组织在解离和分选过程中会受到应激影响。
   7. 收集Isl^MN:GFP小鼠胚胎的面神经运动神经元及四肢组织，分别作为流式细胞分选（FACS）中的GFP阳性和GFP阴性对照。四肢组织为GFP阴性，因为在该胚胎发育阶段，SMN的GFP阳性轴突尚未延伸至四肢。

2. 组织解离

注意：每次实验的总解离时间通常为 1.5 小时。

1. 在解离前30分钟，将木瓜蛋白酶（papain）和白蛋白-卵黏蛋白抑制剂溶液分装物预热至37 °C。
2. 将显微解剖的组织在低速下短暂离心。
3. 使用P100移液器小心吸除尽可能多的Hibernate E培养基，避免吸取组织。
   注意：此步骤后务必彻底去除残留的Hibernate E，以免影响下一步木瓜蛋白酶解离的效果。
4. 根据每个含有显微解剖组织样本的1.7 mL微量离心管，加入适量体积的木瓜蛋白酶溶液（表1）。
   注意：木瓜蛋白酶的适宜用量已通过优化确定，旨在最大化解离效率的同时最小化对细胞的损伤。
5. 使用P200移液器轻柔吹打8次。所有吹打操作均应轻柔进行，以保持运动神经元的活性。
6. 将含有组织的离心管在37 °C孵育30分钟，每隔10分钟用手指轻弹管壁振荡10次。孵育结束后，用P200移液器对每份悬液轻柔吹打8次，然后在300 × g下离心5分钟。
7. 为确保下一步卵黏蛋白抑制的有效性，使用P1000移液器尽可能吸除上清液并弃去，注意避免吸取组织沉淀。
8. 用适量体积的白蛋白-卵黏蛋白抑制剂溶液（表1）重悬沉淀，使用P200移液器轻柔吹打8次。
9. 静置2分钟，使任何未完全解离的组织碎片沉降至管底。
10. 使用P200移液器尽可能收集上清液，避免吸取未解离的组织，将上清液转移至新的1.7 mL微量离心管中。
11. 若在步骤2.10后仍有部分组织块未解离，可对原始1.7 mL微量离心管中残留的未解离组织重复步骤2.8–2.10，以最大限度提高最终解离细胞的得率，同时避免对已在步骤2.10上清液中解离的细胞造成额外损伤。
12. 在300 × g下离心5分钟，沉淀细胞。使用P1000移液器小心吸除并弃去上清液。
13. 用适量体积的解离培养基（表1）重悬沉淀，使用P1000移液器吹打8次。最终悬液的适宜体积已确定，以确保细胞密度不超过10⁷ cells/mL（过高会堵塞流式细胞仪的液流），同时避免细胞过度稀释（过低会导致分选速度减慢）。
14. 将细胞悬液通过70 µm细胞滤网过滤，以去除任何大块聚集体或未消化的组织。将滤过的悬液转移至5 mL圆底聚苯乙烯试管中，置于冰上保存，待用。

3. 荧光激活细胞分选（FACS）

注意：本实验方案使用配备15 mW 405 nm紫色激光、100 mW 488 nm蓝色激光、75 mW 594 nm橙色激光和40 mW 640 nm红色激光的流式细胞分选仪进行优化。细胞在无菌PBS中作为鞘液，在无菌条件下通过100 µm喷嘴进行分选。为尽量减少细胞应激，设置样品压力为1−3，使每秒获取的事件数最多为1,000−4,000个。每次实验的总流式分选时间通常为1−2小时。

1. 设置前向散射和侧向散射的电压，以便正确可视化细胞群体。为细胞分选设置合适的电压较为复杂，需要有经验的流式细胞分选（FACS）操作人员。
2. 为了区分不同的细胞群体，根据前向散射面积（FSC-A）所反映的细胞大小与侧向散射面积（SSC-A）所反映的细胞内部复杂性进行细胞作图。如图2Aa和图Ba所示，在活细胞周围绘制门控区域，以排除碎片和死亡细胞。将门控区域内细胞归为群体1（P1）。
3. 为排除细胞团块和双联体，接下来根据侧向散射宽度（SSC-W）与侧向散射面积（SSC-A）对P1细胞进行作图。将单细胞群体设门为群体2（P2）（图2Ab和图Bb）。
4. 根据前向散射宽度（FSC-W）与前向散射面积（FSC-A）对P2细胞进行作图，并将单细胞群体设门为群体3（P3）（图2Ac和图Bc）。
   注意：步骤3.3和3.4中连续使用两个门控可排除细胞团块和双联体（高FSC-W和高FSC-A）。
5. 根据GFP与别藻蓝蛋白（APC）信号对P3细胞设门。APC通道用于检测自发荧光，对该通道设门可避免捕获自发荧光细胞。使用GFP阴性细胞调整FITC/GFP荧光通道的电压。理想情况下，将这些细胞群体的门控位置设定在10²附近。针对每种运动神经元类型，分别设定GFP阳性群体4（P4）的门控阈值（图2Ad和图Bd）。
   注意：为获得纯培养物，SMN的GFP门控应显著高于CN3s/CN4s（图2Ad和图Bd）。若SMN培养物的GFP门控过低，会导致胶质细胞和非运动神经元污染。这可能是由于启动子存在泄漏，导致部分胶质细胞和非运动神经元中有低水平的GFP表达。GFP阳性细胞占总细胞的比例通常为：CN3s/CN4s为0.5−1.5%，SMNs为1.5−2.5%。若解剖操作成功，这些数值可作为参考基准，用于确定GFP阳性门控的适当位置（图2Ae和图Be）。
6. 按照制造商的操作说明进行FACS分选。将P4细胞收集至预先装有500 µL运动神经元培养基的新鲜1.7 mL微量离心管中。分选后置于冰上保存，直至接种。
   注意：尽管可将细胞直接分选至孔板中，但这会导致每孔细胞数量不均。建议将细胞分选至1.75 mL微量离心管中，再手动接种，以获得更均匀的细胞分布。

4. 纯化原代运动神经元的培养

1. 将FACS分离的CN3/CN4和SMN悬液用预热至37 °C的运动神经元培养基分别稀释至浓度为5 × 10³ 和1 × 10⁴ 个细胞/mL。
   注意：一个E11.5胚胎大约可获得1 × 10³ 个CN3/CN4细胞和7 × 10³ 个SMN细胞。然而，实际得率在很大程度上取决于解剖组织的纯度、细胞解离的充分性以及FACS过程中GFP门控阈值设置的准确性。
2. 将预先包被多聚D-赖氨酸（PDL）和层粘连蛋白的96孔板从37 °C细胞培养孵箱转移至超净工作台，吸除每孔中的层粘连蛋白溶液。立即使用该板和盖玻片，无需洗涤。
3. 向PDL/层粘连蛋白包被的96孔板每孔加入200 µL稀释后的CN3/CN4和SMN悬液。最终每孔细胞密度应分别为CN3/CN4：1 × 10³ 个细胞/孔，SMN：2 × 10³ 个细胞/孔。
   注意：在96孔板中，SMN的初始接种密度（2 × 10³ 个细胞/孔）是CN3/CN4（1 × 10³ 个细胞/孔）的两倍，以确保在体外培养第2天和第9天（DIV）时获得相近的最终运动神经元数量和密度（分别为每孔4−6 × 10² 和2−4 × 10² 个细胞）。
4. 将神经元置于37 °C、5% CO₂ 的孵箱中培养。
5. 每5天换液一次，移除一半旧培养基（100 µL），并补充等体积的新鲜运动神经元培养基。确保在体外培养第1天（1 DIV）可见神经元突起，并在第14天（14 DIV）时突起变得更粗更长（图3）。在长期培养中，神经元胞体增大，并倾向于聚集，尤其是SMN（图3）。
   注意：所有培养基和溶液更换操作均应保留一半原始培养基体积，以避免培养细胞脱落。此原则也适用于固定和免疫细胞化学（ICC）步骤。若完全移除培养基，无论操作多么轻柔，大多数细胞都会脱落并被冲洗掉。

结果

表1：解离步骤中使用的木瓜蛋白酶、卵白蛋白-卵黏蛋白抑制剂及终悬浮液的适当体积。 木瓜蛋白酶和卵白蛋白-卵黏蛋白抑制剂的适当体积是根据多次优化实验，对厂家说明书推荐值进行调整后确定的。由于组织在解离和分选过程中易受损伤，建议合并收集超过10个腹侧中脑组织和超过3个腹侧脊髓组织。木瓜蛋白酶的体积需兼顾解离效率与操作对细胞造成的应激反应；卵白蛋白-卵黏蛋白抑制剂溶液的体积为木瓜蛋白酶体积的一半。Hibernate E终悬浮液的适当体积应确保细胞密度不超过10⁷ 个细胞/mL，同时避免细胞过度稀释。

中脑数量 (X)

木瓜蛋白酶

卵白蛋白-卵黏蛋白

Hibernate ...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
B27添加剂（50倍浓缩，无血清）	赛默飞世尔科技	17504-044
BD FACSAria llu SORP 流式细胞仪	BD生物科学	-	该系统配备4个激光器，分别为405 nm、488 nm、594 nm和640 nm。
BD Falcon 70μm 尼龙细胞滤网	CORNING	352350	用于在流式细胞术分选前过滤解离的细胞。
BD Falcon 圆底带盖离心管（带卡扣盖）	CORNING	352054
BDNF 人源	ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd.	CYT-207
细胞培养微孔板，96孔，聚苯乙烯，F型底（烟囱型孔）	Greiner Bio-One 国际公司	655090	我们尝试了多种96孔板，此款在免疫细胞化学检测前的培养和分析中效果最佳
CNTF 人源	ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd.	CYT-272
4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）	赛默飞世尔科技	D1306
二甲基亚砜	Sigma-Aldrich	D2650	DMSO
Dumont #5 镊子，不锈钢尖端，尺寸 0.05 × 0.01 mm，Biologie 尖头	Roboz 外科手术器械	RS-5015
Forskolin	赛默飞世尔科技	BP25205
GDNF 人源	ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd.	CYT-305
GlutaMAX 补充剂	赛默飞世尔科技	35050-061
Hanks' 平衡盐溶液 (HBSS)	赛默飞世尔科技	14175-095
休眠 E	BrainBits	HE
低荧光 E 型休眠液	BrainBits	HELF	应降低会干扰胚胎GFP表达观察的荧光。
马血清，热灭活，新西兰来源	赛默飞世尔科技	26050-070
IBMX	Tocris Cookson	2845	异丁基甲基黄嘌呤
层粘连蛋白	赛默飞世尔科技	23017-015
Leibovitz L15 培养基	赛默飞世尔科技	11415064
2-巯基乙醇	Sigma-Aldrich	M6250
显微解剖剪	Roboz 外科手术器械	RS-5913
Micro Knife 4.75" 1.7 x 27 mm 刀片	Roboz 外科手术器械	RS-6272
Moria 迷你穿孔匙	Fine Science Tools	10370-19
奥林巴斯 1.7 ml 微量离心管，透明	Genesee Scientific	22-281	这些是我们之前描述过的试管 "1.7 mL 微量离心管" 在该背景下。
木瓜蛋白酶解离系统	沃辛顿生化公司	LK003150	使用该试剂盒配制木瓜蛋白酶溶液和白蛋白-卵黏蛋白抑制剂溶液。
青霉素-链霉素（10,000 U/ml）	赛默飞世尔科技	15140-122
磷酸盐缓冲液（PBS）	赛默飞世尔科技	10010-023
聚D-赖氨酸（PDL）	MilliporeSigma	A-003-E
SMZ18 和 SMZ1500 变焦体视显微镜配备 DS-Ri1 相机	尼康	-	解剖操作完成后，在这些荧光显微镜下拍摄解剖后的胚胎和组织图像。
Sylgard 170 黑色硅胶封装材料 - A+B 组分，0.9 公斤装套件	道康宁	1696157	我们使用该试剂盒制备解剖培养皿。
TC处理培养皿，100 × 20 mm	Genesee Scientific	25-202	我们使用这种培养皿制作解剖用培养皿。
桑氏敷料镊 4.5" 锯齿状，2.2 mm 尖端宽度	Roboz 外科手术器械	RS-8100
蔡司LSM 700系列激光扫描共聚焦显微镜及Zen软件	卡尔·蔡司	-	使用以下设备拍摄了胚胎的共聚焦图像