在细胞生产设施中处理神经干细胞培养

摘要

来源：Stover, A. E.，等. 在封闭式细胞培养系统中培养人多能干细胞和神经干细胞用于基础与临床前研究。J. Vis. Exp. (2016)。

该视频概述了在细胞培养工作站中维持受控环境以培养和维持神经干细胞的操作流程。这些操作包括设定培养室条件、清洁程序以及培养基的制备，从而实现最大程度的无菌性和可重复性，并取代传统方法。

方案

1. 初始设置

1. 设定气体和温度浓度
   1. 使用软件时，点击图形界面左上角的“Guest”标签。使用指定的用户名和密码登录系统。确保每位用户均有各自的用户名和密码。
   2. 单击模块进行调整（图1）。在显示当前设置的新窗口中，点击现有的 O₂ 在“设定点”下方设置点值，并输入此模块所需的 O₂ 浓度水平。输入 5% O₂₂ 如果多能干细胞将在本模块中进行培养或操作，且氧气浓度为9% O₂₂ 如果神经干细胞将被培养或操作，请点击绿色对勾以确认设定值。
      注意： 两个模块无法调节气体：层流罩和显微镜腔室。层流罩内的气体浓度为大气浓度，而操作腔室内的气体浓度则被动维持与显微镜腔室一致。
   3. 对 CO 重复此步骤₂设定5% CO的控制点₂ 除缓冲室外，所有模块均需调节，缓冲室仅调节 O₂.
   4. 监测标记为“过程值”的当前气体浓度，以确保其达到新的设定点。
   5. 调节所有模块的气体设定值至适当数值。匹配 CO₂ 和 O₂ 将相互连通的腔室调节至相同水平。例如，将工艺腔室调节至5% O₂₂ 在打开培养细胞的5% O₂培养箱之前₂。同时，改为5% O₂₂ 在此期间，任何用于向工艺腔室添加物品的缓冲腔室。
   6. 使用同一界面调节气体参数，将工艺室温度设置为 37 °C。同时，工艺室底部温度也应设置为 37 °C。
   7. 点击每个培养箱下方的孵育模块组，将模块组的温度调节至 37 °C。
2. 缓冲室的操作
   1. 收集完成指定任务（喂养、传代、染色、 等等。开始时即准备好所有材料，以避免工作流程延误。将所有物品用70%乙醇充分喷洒，并在超净台内晾干。切勿直接喷洒细胞培养瓶或培养板，应使用浸透70%乙醇的无菌纱布轻轻擦拭。
   2. 确保缓冲室的外门和内门均已牢固关闭，然后打开外侧门，将物品放入其中。
   3. 关闭外门。在软件中选择缓冲模块，点击稀释因子选项卡。在对数因子框中输入1。点击开始。
      注： “稀释因子”是指缓冲模块内的气氛将被抽空，并更换一次洁净的、经HEPA过滤的气体。
   4. 当图形界面停止闪烁“稀释因子”时，打开缓冲室的内门，将材料放入工艺腔室内。
      注意：切勿让内门和外门同时打开，且当缓冲室尚未完成稀释因子处理时，不得打开内门。
   5. 首先，从处理舱中取出物品，并确保缓冲舱已完成稀释处理。然后打开内门，将待取出的物品放入，关闭内门。随后打开外门，取出物品。
      注意：在打开外门之前，不得运行稀释因子。

2. 细胞的接种与培养

1. 培养箱设置
   1. 在每个培养箱底部的水盘中放置3个培养皿。向这些培养皿中加入无菌水，不要直接向水盘注水。保持这些培养皿中的水位，因为这对维持培养箱的相对湿度（RH）设定值至关重要。
   2. 在图形界面中，点击培养箱。在设定值下，点击现有的相对湿度（RH）数值，并输入85%。点击绿色对勾以确认该数值。
2. 细胞生产设施的细胞准备
   1. 若尚未完成，请根据所引入细胞类型的要求，调节缓冲室、操作室和培养箱的气体设定值。
   2. 使用无菌纱布和非易燃消毒剂清洁操作室表面。切勿使用含过氧乙酸的消毒剂；在封闭系统中，其强烈且持久的蒸气对哺乳动物细胞具有毒性。应使用含苯扎氯铵的产品。
   3. 继续进行消毒。清洁手套以及常接触的表面，如门把手。应彻底但适量使用消毒剂，因操作室内液体过多会增加湿度、导致冷凝，并可能促进微生物生长。
   4. 用70%乙醇清洁层流罩和缓冲室的表面，并使其自然干燥。将细胞培养瓶或培养板（本例中为PSCs（多能干细胞）或NSCs（神经干细胞））放入层流罩内，并用浸透乙醇的无菌纱布快速擦拭其外表面。
   5. 将培养瓶或培养板放入缓冲室，并运行稀释因子程序（步骤1.2.3）。
   6. 稀释因子程序完成后，立即将培养瓶或培养板转移至相应的培养箱。由于培养箱位于操作室后部，可将搁板拉出至操作室内以便放置细胞。应避免不必要或长时间打开培养箱门，因为操作室内的空气比培养箱内干燥得多，会导致培养箱内湿度显著下降。
3. 细胞培养换液
   1. 准备培养基组分，如移液管、电子移液器、纱布和消毒剂。同时准备一个废液容器用于盛装用过的细胞培养基，但不要在其中加入漂白剂。通过缓冲室将上述材料带入操作室，方法见第1.2节。合理摆放物品，以获得最佳操作空间。避免将未使用的物品放置在操作室中央。
   2. 将培养基容器略微松盖，使培养基与系统内的CO₂和O₂水平达到平衡。某些PSC培养基制造商建议不要在37 ºC下预热培养基；若如此，请使用缓冲室使培养基平衡。让培养基平衡20分钟。
   3. 使用合适的移液管和电子移液器从孔板中移除旧培养基。对于PSCs，保留少量旧培养基以防止换液过程中细胞干燥；对于NSCs，移除一半旧培养基。将废液移入废液容器中。
   4. 将使用过的移液管放回原包装纸中，并移至操作室一侧或指定用于废弃物移出的缓冲室。使用新的无菌移液管向细胞培养板中加入新鲜培养基，并将培养板放回指定的培养箱中。
   5. 换液结束后，用消毒剂喷洒纱布，彻底清洁操作室的地面和门把手。若系统中同时培养多个细胞系，应在每次换液之间进行灭菌处理，以最大限度降低交叉污染的风险。
   6. 完成后，通过任一缓冲室移出废弃物或其他不需要的物品。

3. 细胞培养物的传代

1. 多能干细胞（PSCs）或神经干细胞（NSCs）的酶消化传代
   1. 准备传代所需的所有物品。包括培养基、酶或非酶细胞解离缓冲液（后者仅适用于NSCs）、DPBS（Dulbecco磷酸盐缓冲液）、培养板或培养瓶、细胞外基质（ECM）、离心管和移液管。通过缓冲舱将这些物品带入系统。
   2. 如前所述，用ECM包被新的培养板或培养瓶9,10。某些ECM（例如来源于小鼠肉瘤细胞系的ECM）在4至15 °C之间才呈液态，因此在加热的操作舱内操作时，应使用无菌冰块或冰袋保持ECM低温。
   3. 吸除培养物中的废弃培养基，并将其弃入废液容器中。
   4. 用1 ml DPBS/孔冲洗孔或培养瓶表面，随后弃去DPBS。
   5. 向每孔加入1–2 ml预热的酶溶液。仅当细胞密度极高时才需使用2 ml。
   6. 立即将培养皿或培养瓶转移至显微镜舱内观察培养物，观察单个细胞是否开始从皿底脱落。切勿等到细胞完全悬浮后再进行下一步操作。
   7. 将细胞重新移回主操作舱。使用5 ml移液管，按每1 ml酶液加入4 ml DPBS的比例添加DPBS，然后用力反复吹打以使细胞从孔底脱落。若在多孔板中对多个孔进行传代，应在逐个孔吹打前先向各孔加入DPBS。
   8. 将含有酶和PBS的细胞悬液转移至适当大小的离心管中。
   9. 若细胞生产设施中无离心机，应将离心管严密封闭，放入缓冲舱并关闭舱门。
   10. 从层流一侧取出缓冲舱内的离心管，在室温下以100 × g离心5分钟。
   11. 用70%乙醇喷洒离心管，并通过缓冲舱和稀释因子将其带入操作舱。
   12. 吸除上清液，将细胞重悬于2 ml PSC或NSC培养基中。若传代PSCs，需在培养基中加入ROCK（Rho相关蛋白激酶）抑制剂，终浓度为10 µM。
   13. 使用血细胞计数板计数细胞，并确定所需接种的孔数或板数。PSCs接种密度为5 × 10⁴ – 1 × 10⁵ 个细胞/cm²；NSCs按1:2比例传代。
       注意：NSCs常形成团块，在血细胞计数板中难以准确计数。
   14. 若需冻存细胞，应确保所有耗材和冻存培养基已准备妥当并置于操作舱内。DMSO（二甲基亚砜）在37 °C下对细胞毒性极强，作用迅速。将异丙醇夹套式冻存盒置于层流罩内室温保存。一旦冻存管填充并密封完毕，立即通过缓冲舱将其从操作舱中取出。
2. 多能干细胞（PSCs）的手动传代
   1. 如前所述，确认培养物需要传代。若确认，则准备已包被细胞外基质的新培养板或培养瓶，并完全更换培养基。
   2. 用无菌纱布蘸取少量不可燃消毒剂清洁显微镜舱，消毒剂过多会导致过度起雾。仅需清洁手套、地面区域和载物台。将数个独立包装的200 µl或1,000 µl移液枪头带入舱内。
   3. 将PSCs培养板带入显微镜舱，取下盖子并倒扣在刚清洁过的地面上。盖子朝上放置会使底部直接暴露于气流中，增加污染风险。
   4. 打开一个移液枪头包装，借助显微镜观察培养物，用枪头尖端挑取形态良好的克隆进行机械分离。
      注意：若操作者更习惯，可将移液枪头连接在移液器上使用。
   5. 重新盖上培养板盖子，并将培养板移回操作舱。
   6. 吸除新板中多余的ECM，将旧板中的培养基（含悬浮的克隆片段）转移至新板中。若旧板中仍有未达传代标准的克隆，也应继续给予培养基进行喂养。

结果

图1. 细胞生产设施的图形界面。（A）CPF的图形界面为默认屏幕，与图3所示的CAD图纸一致。鼠标点击缓冲模块1可打开其控制界面（B），其中O₂值被设定为与处理腔室一致。同样，点击处理腔室或培养箱1可分别调出其对应的控制界面（C和D），在其中可根据需要更改或监控相关参数。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Xvivo 系统	Biospherix	定制生产
Xvivo 软件	Biospherix	版本 i.o.2.1.2.1
O2 气体分配装置	Amico	P-M2H-C3-S-U-OXY
CO2 气体分配装置	Amico	M2H-C3-D-U-CO2
N2 气体分配装置	Western Innovator	CTM75-7-2-2-BM
O2 气体
CO2 气体
N2 气体
培养皿
水
无菌纱布
70% 乙醇	BDH	BDH1164-4LP
基于苯扎氯铵的消毒剂
杜氏磷酸盐缓冲液
基于 Hank's 液的细胞解离缓冲液	Life Technologies	13150-016
2 mL 血清移液管	VWR	89130-894
5 mL 血清移液管	Olympus Plastics	12-102
10 mL 血清移液管	Olympus Plastics	12-104
25 mL 血清移液管	Olympus Plastics	12-106
50 mL 血清移液管	Olympus Plastics	12-107
6 孔板	Corning	353046
20 µL 移液器吸头	Eppendorf	22491130
200 µL 移液器吸头	Eppendorf	22491148
1000 µL 移液器吸头	Eppendorf	22491156
配备 DP21 相机和荧光功能的显微镜	Olympus Corporation	CKX41
磷酸盐缓冲钠溶液	Hyclone	9236
二甲基亚砜	Protide	PP1130
手套