使用磁性激活细胞分选法纯化CD31+内皮前体细胞

摘要

来源：Matsuo, K.，等。具有成熟免疫表型的人诱导性多能干细胞向脑微血管内皮样细胞的分化。J. Vis. Exp. (2023)。

本视频展示了一种利用磁性激活细胞分选（MACS）技术从培养物中纯化 CD31⁺ 内皮祖细胞（EPCs）的方法。首先将细胞悬液与荧光染料标记的抗体孵育，该抗体可特异性结合 EPCs 上的 CD31 分子。随后加入抗体复合物，该复合物可结合荧光染料，再加入聚合物包被的磁性纳米颗粒，该颗粒可结合抗体复合物，从而完成对 CD31⁺ EPCs 的标记。最后通过磁场对标记的细胞进行纯化，弃去 CD31^- 的细胞。

方案

人诱导性多能干细胞（hiPSC）系 HPS1006 由日本文部科学省/日本医疗研究开发机构（MEXT/AMED）国家生物资源项目下属的理化学研究所生物资源中心（RIKEN BRC）提供。

1. 诱导人诱导多能干细胞分化为内皮祖细胞（EPCs）

1. 细胞外基质（ECM）包被板和试剂
   1. 通过将2.5 mg基底膜基质凝胶分装至50 mL离心管中，于-20 °C保存不超过6个月，制备基底膜基质包被的12孔板。向管中加入30 mL已冷藏（4 °C）的冷Dulbecco改良Eagle培养基/营养混合物F-12（DMEM/F12），用移液器轻轻吹打混匀，直至凝胶完全解冻。然后将500 µL溶液加入12孔板的每个孔中。将板置于培养箱（37 °C，5% CO₂）中孵育至少1小时。
      注意： 基底膜基质凝胶对温度敏感，应按照制造商说明进行分装和包被操作。不同批次间细胞外基质蛋白浓度可能存在差异。为确保准确性，应根据具体批次的批号查阅质量证书，确定确切浓度。例如，若确切浓度为10.0 mg/mL，则使用250 µL凝胶以获得总量2.5 mg。
   2. 通过将ROCK抑制剂溶于无菌水中，配制成10 mM的rho-激酶（ROCK）抑制剂储备液（表1）。将储备液分装为100–200 µL/管，于-20 °C保存，避免反复冻融。
   3. 将5 g L-抗坏血酸溶于50 mL无菌水中，配制成100 mg/mL的L-抗坏血酸储备液，并于-20 °C保存（表1）。向500 mL高级DMEM/F12培养基中加入6.25 mL谷氨酰胺和305 µL L-抗坏血酸储备液，制备LaSR培养基（表1）。于2–8 °C保存不超过2周。
   4. 将CHIR99021溶于未稀释的二甲基亚砜（DMSO）中，配制成终浓度为10 mM的CHIR99021溶液（表1）。将溶液分装为100–200 µL/管，避免反复冻融，于-20 °C保存不超过1年。工作分装液可于4 °C保存不超过1个月。
   5. 向450 mL DMEM/F12培养基中加入50 mL热灭活胎牛血清，配制DMEM/F12-10培养基。于2–8 °C保存不超过1个月（表1）。
   6. 向467 mL Dulbecco磷酸盐缓冲液（PBS）中加入33.3 mL 7.5%牛血清白蛋白（BSA），配制流式缓冲液-1（表1）。于2–8 °C保存不超过6个月。
2. 单细胞化hiPSC的接种及EPC分化前扩增（第-3天至第-1天）
   1. 当6孔板中的hiPSC集落未出现自发分化且达到适宜传代密度（通常约为80%汇合度，即2.5–3.5 × 10⁶个细胞）时，开始分化。在显微镜下仔细观察自发分化的细胞，以判断是否需要多次传代以清除未分化细胞。有关细胞培养基和细胞外基质的信息，请参见步骤1.4.15下方的注释。
   2. 吸除培养基，向各孔中加入1 mL消化试剂，于37 °C孵育5–7分钟。用移液器轻轻吹打孔底表面2–3次，使细胞解离并单细胞化。
   3. 将解离的细胞转移至含4 mL hiPSC维持培养基的15 mL离心管中，充分重悬。保留10 µL用于细胞计数。
   4. 于20–25 °C、200 × g离心5分钟使细胞成团。计数细胞，并计算在基底膜基质包被的12孔板（步骤1.1.1）中达到适宜hiPSC密度（每孔75–400 × 10³个细胞）所需的体积。
   5. 吸除包被液，向每孔中加入含10 µM ROCK抑制剂的1 mL hiPSC培养基（1:1,000稀释）。离心后，吸除上清液，用1 mL hiPSC培养基重悬细胞沉淀。
   6. 根据步骤1.2.4确定的体积，将所需量的hiPSC加入12孔板的各孔中。分化一个hiPSC克隆可能需要2–4块12孔板。请参考步骤1.2.4以确定接种所需的板数。
   7. 将板置于培养箱（37 °C，5% CO²）中。在培养箱内轻轻前后、左右滑动板，使细胞均匀分布。
   8. 次日（即第-2天），更换为不含ROCK抑制剂的2 mL hiPSC维持培养基。下一日（第-1天），更换为2 mL新鲜hiPSC维持培养基。
3. 使用糖原合成酶激酶3（GSK-3）抑制剂CHIR99021诱导EPC（第0天至第5天）
   1. 第0天，将各孔中的hiPSC维持培养基更换为含8 µM CHIR99021的2 mL LaSR培养基。
   2. 第1天，吸除培养基，加入含8 µM CHIR99021的新鲜LaSR培养基2 mL。
   3. 第2、3、4天，更换为不含CHIR99021的新鲜LaSR培养基2 mL。
4. 磁珠激活细胞分选（MACS）纯化CD31+ EPC（第5天）
   1. 第5天，吸除培养基，向每孔中加入1 mL消化试剂，于37 °C孵育6–8分钟。
   2. 用移液器将细胞解离并单细胞化，通过40 µm细胞滤器过滤，收集至含10 mL DMEM/F12-10培养基的50 mL离心管中。来自两个以上12孔板的细胞悬液应分装至至少两个50 mL离心管中。
   3. 通过加入DMEM/F12-10培养基（总量至50 mL）终止消化反应。充分吹打混匀，保留10 µL用于细胞计数。于20–25 °C、200 × g离心5分钟使细胞成团。
   4. 吸除上清液后，加入10 mL DMEM/F12-10培养基，将细胞悬液转移至新的15 mL离心管中。于20–25 °C、200 × g离心5分钟使细胞成团。
   5. 吸除上清液，用流式缓冲液-1重悬细胞，密度为每100 µL缓冲液含1.0 × 10⁷个细胞。
   6. 按1:100比例加入Fc受体（FcR）阻断试剂，孵育5分钟后，加入稀释1:200的异硫氰酸荧光素（FITC）标记CD31抗体。于20–25 °C避光孵育30分钟。
   7. 加入10 mL流式缓冲液-1，保留10 µL悬液用于流式细胞术分析，以确定CD31⁺细胞比例（图1）。
   8. 于20–25 °C、200 × g离心5分钟使细胞成团。吸除上清液，用流式缓冲液-1重悬至密度为每100 µL溶液含1.0 × 10⁷个细胞。按每100 µL细胞悬液加入5 µL FITC分选试剂盒。充分吹打混匀，于20–25 °C避光孵育15分钟。
   9. 按每100 µL细胞悬液加入5 µL磁性纳米颗粒，充分吹打混匀，于20–25 °C避光孵育10分钟。
   10. 将细胞悬液转移至5 mL流式管中，加入流式缓冲液-1至总体积2.5 mL。将流式管置于磁铁上5分钟。
   11. 连续操作，将磁铁和流式管倒置，倾倒出未被FITC-CD31抗体标记的细胞悬液。保持倒置状态2–3秒，再移除残留液体。在将管恢复直立前，吸除管口边缘的液滴。
   12. 从磁铁上取下流式管，加入2.5 mL流式缓冲液-1，洗涤残留的CD31⁺细胞。轻轻吹打2–3次使细胞重悬。将流式管放回磁铁上5分钟。
   13. 重复步骤1.4.11–1.4.12三次，再重复步骤1.4.11一次，共洗涤四次。
   14. 从磁铁上取下流式管，加入适量适宜培养基（如用于长期内皮细胞培养的人内皮细胞无血清培养基[hECSR]，或用于冻存的冻存液），重悬纯化的CD31⁺细胞。保留两份10 µL悬液，一份用于细胞计数，另一份用于流式细胞术分析，以评估MACS后样本中CD31⁺细胞的纯度（图1）。若无法立即进行流式分析，可将样品于4 °C保存至分析前。
   15. 此时可将CD31+ EPC冻存。
       注意： 可使用vitronectin包被的12孔板和更稳定的hiPSC维持培养基（mTeSR plus）替代基底膜基质包被板和hiPSC维持培养基（mTeSR1）。制备vitronectin包被的12孔板时，用稀释缓冲液将vitronectin稀释至终浓度10 µg/mL，取500 µL稀释液加入12孔板各孔中，于20–25 °C放置至少1小时。单细胞化hiPSC的接种密度与基底膜基质包被板相当。更换培养基或基质成分可能影响hiPSC的增殖和自发分化，通常需要1–2周适应新培养条件。若使用更稳定的hiPSC维持培养基进行hiPSC维持培养，则该培养基也可用于EPC分化，替代原hiPSC维持培养基。此时，应在第-2天更换该更稳定的hiPSC维持培养基以去除ROCK抑制剂，第-1天的换液步骤可省略。

结果

表1： 各检测所用试剂的详细信息。 每种特定试剂的成分名称及确切用量均有说明。

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特定试剂	成分	体积
乙酸，0.5 mg/mL 溶液	乙酸	119 μL
	无菌细胞培养用水	250 mL
封闭缓冲液	脱脂奶粉	5 g

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.22 mm 注射器滤器	TPP	99722
15 mL 离心管	Falcon	352196
40 μm Falcon 细胞筛	Falcon	352340
5 mL 圆底管	SPL	40005
50 mL 离心管	Falcon	352070
96 孔圆底板	SPL	34096
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964-500ml
乙酸	Sigma-Aldrich	695092
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634
一体式荧光显微镜	Keyence	BZ-X810
B-27 补充剂 (503)，无血清	Thermo Fischer Scientific	17504044
牛血清白蛋白 (BSA)，7.5% 溶于 dPBS	Sigma-Aldrich	A8412
CellAdhere 稀释缓冲液	STEMCELL Technologies	ST-07183
CHIR99021	Selleck Chemicals	S1263
人胎盘来源的 IV 型胶原蛋白	Sigma-Aldrich	C5533
Corning 组织培养板 (12 孔)	Corning	3512
Corning 组织培养板 (6 孔)	Corning	3506
冻存管内盖 2.0 mL	Watson	1396-201S
二甲基亚砜 (DMSO)，无菌	Sigma-Aldrich	D2650
DMEM (13)，[+] 4.5 g/L D-葡萄糖，[-] L-谷氨酰胺，[-] 丙酮酸	Thermo Fischer Scientific	31053-028
Dulbecco's (d) PBS (不含钙、镁)	Thermo Fisher	14190250
Dulbecco 改良 Eagle 培养基/营养混合物 F-12 (DMEM-F12)	Thermo Fischer Scientific	11320074
EasySepFITC 阳性选择试剂盒 II	STEMCELL Technologies	18558
EasySepMagnet	Stemcell Technologies	18000
乙二胺四乙酸溶液 0.02% 溶于 DPBS	Sigma	E8008-100ML
胎牛血清，经鉴定合格	Thermo Fischer Scientific	10270106
HEPES 缓冲液	Thermo Fischer Scientific	15630-056
人内皮细胞无血清培养基 (hESFM)	Thermo Fischer Scientific	11111-044
人成纤维细胞生长因子 2 (FGF2)	Tocris	233-FB-500
iPS 人诱导多能干细胞	Riken RBC	HPS1006
卡那霉素硫酸盐 (100x)	Thermo Fischer Scientific	15160-047
L-抗坏血酸-2-磷酸三镁盐水合物	Sigma-Aldrich	A8960-5G
L-谷氨酰胺 200 mM (1003)	Thermo Fischer Scientific	25030-024
Matrigel，生长因子减少型	Corning	354230
MEM NEAA (1003)	Thermo Fischer Scientific	11140-035
ROCK 抑制剂 Y-27632	Tocris	1254
RPMI 1640 培养基，Tris 碱基	Sigma-Aldrich	93362
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100