使用磁激活细胞分选纯化 CD31 + 内皮前体细胞

摘要

来源:Matsuo， K. 等人 人诱导多能干细胞分化为具有成熟免疫表型的脑微血管内皮细胞样细胞。J. Vis. Exp. （2023 年）。

该视频演示了一种使用磁激活细胞分选 （MACS） 从培养物中纯化 CD31⁺ 内皮祖细胞 （EPC） 的技术。细胞悬液用与 EPC 上的 CD31 结合的荧光团偶联抗体处理。完成 CD31⁺ 内皮祖细胞的标记包括添加与荧光团结合的抗体复合物和与抗体复合物结合的聚合物包被磁性纳米颗粒。然后使用磁场纯化标记的细胞，丢弃任何 CD31^- 细胞。

方案

人诱导多能干细胞 （hiPSC） 系 HPS1006 由 RIKEN BRC 通过日本 MEXT/AMED 国家生物资源项目提供。

1. 诱导 hiPSC 分化为内皮祖细胞 （EPC）

1. 细胞外基质 （ECM） 包被的板和试剂
   1. 通过将 2.5 mg 基质凝胶分装到 50 mL 离心管中来制备基底膜基质包被的 12 孔板，以便在 -20 °C 下储存长达 6 个月。将 30 mL 冷的 Dulbecco 改良的 Eagle 培养基/营养混合物 F-12 （DMEM/F12） 加入试管中，该混合物已保存在冰箱 （4 °C） 中。通过移液轻轻混匀，直到凝胶解冻，然后向 12 孔板的每个孔中加入 500 μL 溶液。将板置于培养箱（37°C，5% CO₂ ）中至少1小时
      注意:基底膜基质凝胶对温度敏感，应根据制造商的等分和板涂层说明进行处理。细胞外基质蛋白的浓度可能因批次而异。为确保准确性，应在特定批次的质量证书表上使用批号提及确切浓度。例如，如果精确浓度为 10.0 mg/mL，则使用 250 μL 凝胶，总共 2.5 mg。
   2. 通过将 ROCK 抑制剂溶解在无菌水中至浓度为 10 mM 来制备 rho 激酶 （ROCK） 抑制剂储备液（表 1）。将储备液分装成 100-200 μL 体积，并在 -20 °C 下储存以避免冻融循环。
   3. 通过将 5 g L-抗坏血酸溶解在 50 mL 无菌水中，制备 100 mg/mL 的 L-抗坏血酸储备液，并储存在 -20 °C（表 1）。将 6.25 mL 谷氨酰胺和 305 μL L-抗坏血酸储备液添加到 500 mL 高级 DMEM/F12 中，制成 LaSR 培养基（表 1）。在 2-8 °C 下储存长达 2 周。
   4. 通过将CHIR99021溶解在未稀释的二甲基亚砜 （DMSO） 中至终浓度为 10 mM 来制备CHIR99021溶液（表 1）。将溶液分装成 100-200 μL 体积以避免冻融循环，并在 -20 °C 下储存长达 1 年。将储备溶液的工作等分试样在 4 °C 下储存长达 1 个月。
   5. 将 50 mL 热灭活胎牛血清添加到 450 mL DMEM/F12 中，制备 DMEM/F12-10 培养基。将培养基在 2-8 °C 下储存长达 1 个月（表 1）。
   6. 通过将 33.3 mL 的 7.5% 牛血清白蛋白 （BSA） 添加到 467 mL 的 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中来制备流动缓冲液-1（表 1）。在 2-8 °C 下储存长达 6 个月。
2. 单一化 hiPSC 的接种和扩增以进行 EPC 分化（第 -3 天至第 -1 天）
   1. 当 6 孔板中的 hiPSC 集落没有显示自发分化并且具有适合传代的密度时，开始分化，通常约为 80% 汇合度（2.5-3.5 x 10^{个 6} 个细胞）。在显微镜下仔细监测自发分化的细胞，以确保是否需要多次传代以消除未分化的细胞。有关细胞培养基和细胞外基质的信息，请参阅步骤 1.4.15 下面提供的注释。
   2. 吸出培养基，向孔中加入 1 mL 解离试剂，并在 37 °C 下孵育 5-7 分钟。通过将解离试剂溶液轻轻移液到孔表面两到三次，使细胞解离和单一化。
   3. 将分离的细胞转移到含有 4 mL hiPSC 维持培养基的 15 mL 试管中，并彻底重悬细胞。保留 10 μL 等分试样用于细胞计数。
   4. 通过在 20-25 °C 下以 200 x g 离心 5 分钟来沉淀细胞。计数细胞并计算所需的体积，以在基底膜基质包被的 12 孔板中达到适当密度的 hiPSC（每孔 75-400 x 10³）（步骤 1.1.1）。
   5. 从孔中吸出涂层溶液，并向每个孔中加入 1 mL 含有 10 μM ROCK 抑制剂的 hiPSC 培养基（1:1,000 稀释度）。离心后，吸出上清液并在 1 mL hiPSC 培养基中解离沉淀。
   6. 将步骤 1.2.4 中测定的所需体积的 hiPSC 添加到 12 孔板的每个孔中。2 到 4 个 12 孔板可能足以区分 hiPSC 克隆。请参阅步骤 1.2.4 以确定接种细胞所需的平板数。
   7. 将板放入培养箱（37 °C，5% CO² ）中。通过在培养箱中轻轻地来回滑动板，然后左右滑动，均匀分布细胞。
   8. 第二天（即第 -2 天），将培养基与 2 mL 不含 ROCK 抑制剂的 hiPSC 维持培养基交换。第二天（第 -1 天），将培养基与 2 mL 新鲜的 hiPSC 维持培养基交换。
3. 用糖原合成酶激酶 3 （GSK-3） 抑制剂CHIR99021诱导 EPC（第 0 天至第 5 天）
   1. 在第 0 天，用 2 mL 含有 8 μM CHIR99021的 LaSR 培养基替换每个孔中的 hiPSC 维持培养基。
   2. 第 1 天，吸出培养基并加入 2 mL 含有 8 μM CHIR99021的新鲜 LaSR 培养基。
   3. 在第 2 天、第 3 天和第 4 天，用 2 mL 缺乏 CHIR99021的新鲜 LaSR 培养基替换培养基。
4. 磁性活化细胞分选 （MACS） 纯化 CD31+ 内皮祖细胞（第 5 天）
   1. 第 5 天，吸出培养基，然后向每个孔中加入 1 mL 解离试剂，然后在 37 °C 下孵育 6-8 分钟。
   2. 用微量移液管解离和单一化细胞，并通过 40 μm 细胞过滤器，将悬浮液过滤到含有 10 mL DMEM/F12-10 培养基的 50 mL 试管中。将从两个以上 12 孔板收集的细胞悬液过滤到至少两个 50 mL 试管中。
   3. 通过添加 DMEM/F12-10 培养基（最多 50 mL）终止消化反应。彻底移液并保留 10 μL 用于细胞计数。通过在 20-25 °C 下以 200 x g 离心 5 分钟来沉淀细胞。
   4. 去除上清液后，加入 10 mL DMEM/F12-10 培养基，并将细胞悬液转移到新鲜的 15 mL 试管中。通过在 20-25 °C 下以 200 x g 离心 5 分钟来沉淀细胞。
   5. 吸出上清液，并以每 100 μL 缓冲液 1.0 x 10⁷ 个细胞的密度重悬于流式缓冲液-1 中。
   6. 以 1:100 的比例加入 Fc 受体 （FcR） 阻断试剂并孵育 5 分钟，然后加入 1:200 稀释的异硫氰酸荧光素 （FITC） 标记的 CD31 抗体。将悬浮液在 20-25 °C 的黑暗中孵育 30 分钟。
   7. 加入 10 mL 流式缓冲液-1，保留 10 μL 悬浮液用于流式细胞术分析，以确定 CD31 ⁺ 细胞的分数（图 1）。
   8. 通过在 20-25 °C 下以 200 x g 离心 5 分钟来沉淀细胞。然后，去除上清液并重悬至每 100 μL 流式缓冲液-1 溶液中 1.0 x 10⁷ 个细胞的密度。加入 FITC 选择混合物（每 100 μL 细胞悬液 5 μL）。通过移液充分混合，并在 20-25 °C 下在黑暗中孵育 15 分钟。
   9. 每 100 μL 细胞悬液加入 5 μL 磁性纳米颗粒，移液管充分，并在 20-25 °C 下避光孵育 10 分钟。
   10. 将细胞悬液转移至 5 mL 流式细胞仪管中，并添加流式缓冲液-1 以达到 2.5 mL 的总体积。将流式细胞术管放入磁力架中 5 分钟。
   11. 在连续运动中，倒置磁力架并倒出含有未用 FITC-CD31 抗体标记的细胞的细胞悬液。将磁铁和管子保持在倒置位置 2-3 秒，然后去除剩余的液体。在将试管恢复到直立位置之前，吸出试管边缘上的任何液滴。
   12. 从磁力架上拿起流式细胞术管，加入 2.5 mL 流式缓冲液-1 以洗涤剩余的 CD31 ⁺ 细胞。通过轻轻上下移液细胞两到三次来重悬细胞。将流管放入磁铁中 5 分钟。
   13. 重复步骤 1.4.11-1.4.12 三次，然后再次重复步骤 1.4.11，总共洗涤四次。
   14. 从磁力架上取流管，向试管中加入指定量的合适培养基（例如，用于延长 EC 培养的人内皮无血清培养基 [hECSR] 或用于冷冻的冷冻培养基）以重悬纯化的 CD31 ⁺ 细胞。保留两个 10 μL 的悬浮液等分试样，一个用于细胞计数，另一个用于进行流式细胞术分析，以评估 MACS 后样品中 CD31 ⁺ 细胞的纯度（图 1）。如果流式细胞仪不能立即使用，请将等分试样储存在 4 °C 直至分析。
   15. 此时冻结 CD31+ EPC.
       注意:玻连蛋白包被的 12 孔板和更稳定的 hiPSC 维持培养基 （mTeSR plus） 可用于代替基底膜基质包被板和 hiPSC 维持培养基 （mTeSR1）。要制备玻连蛋白包被的 12 孔板，请用稀释缓冲液将玻连蛋白稀释至终浓度为 10 μg/mL，然后将 500 μL 稀释溶液转移到 12 孔板的每个孔中。将板在 20-25 °C 下放置至少 1 小时。单一化 hiPSC 的接种密度与用于基底膜基质包被板的接种密度相当。改变培养基或基质组成可能会影响 hiPSC 的增殖和自发分化，通常需要 1-2 周才能适应新的培养条件。如果使用更稳定的 hiPSC 维持培养基进行 hiPSC 维持，则该培养基可用于 EPC 分化，而不是 hiPSC 维持培养基。在这种情况下，应在第 -2 天更换更稳定的 hiPSC 维持培养基以去除 ROCK 抑制剂，并且可以跳过第 -1 天的交换。

结果

表 1:用于检测的特定试剂的详细信息。描述了每种特定试剂的成分名称和确切数量。

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 特异性试剂 成分 卷 乙酸，0.5 mg/mL 溶液 醋酸 119 微升 水、无菌、细胞培养 250 毫升 阻塞缓冲区 脱脂乳 5 克 ...

材料