将人类神经干细胞分化为神经前体细胞和星形胶质前体细胞

摘要

来源：McGrath, E. L., 等. 人胎儿脑神经干细胞的寨卡病毒感染用于免疫细胞化学分析. J. Vis. Exp. (2018)。

本视频展示了利用酶处理及在富含生长因子的培养基中培养，将神经球来源的人类神经干细胞分化为神经前体细胞和星形胶质细胞前体细胞的方法，最终可使其成熟为特化的前体细胞。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 储存培养基的制备与干细胞复苏

1. 通过合并步骤 1.1.1–1.1.5 中的试剂，制备培养基储备液（DFHGPS）。
   1. 加入210 mL含高糖和L-谷氨酰胺的杜尔贝科改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM）D). 4 ˚C下保存。
   2. 加入70 mL含L-谷氨酰胺补充剂的Ham's F12营养混合物（F). 4 ˚C 下保存。
   3. 加入4.2 mL的15 mM HEPES缓冲液（H）并在室温下保存。
   4. 加入4.2 mL的10% D-葡萄糖溶液（G）并在室温下保存。
   5. 加入 2.88 mL 青霉素/链霉素（penicillin/streptomycin）PS) 溶液。将储备液分装为每份3 mL，于-20 °C保存，待用。
      注意： 培养基中青霉素的终浓度为100单位/毫升，链霉素的终浓度为100 µg/mL。在本实验方案的后续步骤中，该培养基将简称为DFHGPS，应于4 °C保存，并在1至2周内使用。如有需要，DFHGPS可按比例相应放大。
2. 细胞回收前一天，用5 mL来自hNSC细胞系前次培养的条件培养基包被一个T75培养瓶，并将其置于含8.5%二氧化碳（CO₂）的37 °C培养箱中孵育。₂过夜。
   注意： 若正在培养人神经干细胞（hNSCs），在换液时保留细胞此前生长的培养基。该培养基被称为条件培养基，因其已被细胞“条件化”。条件培养基可保存于带螺口盖的离心管中，于4 °C保存约7天。请联系通讯作者以获取hNSCs。建议使用条件培养基，但并非绝对必需，尤其是在初次启动hNSCs培养时。
3. 回收当天，在37 °C水浴中将20 mL DFHGPS加入50 mL螺口管中预热至少10分钟，并保持在水浴中直至使用。
4. 在另一个15 mL螺口管中，将10 mL DFHGPS置于37 °C水浴中预热至少10分钟，并保持在水浴中，待步骤1.13使用时取出。
5. 取一个装有冰的容器以及所有培养基组分（表1将所有培养基组分在冰上解冻，并在准备更换培养基时始终保持置于冰上。
6. 获取5 mL条件培养基储备液（4 °C保存），置于37 °C水浴中预热，待步骤1.14使用。若无条件培养基或现有人类胎儿神经干细胞培养物，请参见步骤1.2后的说明。
7. 从步骤1.3中取出50 mL螺口管，放入生物安全柜（BSC）中。将10 mL DFHGPS转移至一个新的15 mL螺口管中，然后将含有剩余10 mL DFHGPS培养基的50 mL管放回37 °C水浴中。
8. 从液氮中取出一支保存的人类神经干细胞（hNSCs）冻存管。若当前无人类胎儿神经干细胞培养物，请参见步骤1.2后的说明。
   注意： 人类神经干细胞最初来源于废弃的人类胎儿脑组织12，并在无基因修饰的情况下进行体外培养维持10。5 × 10⁶ 细胞应解冻并接种于T75培养瓶中。每支冻存管应含有5 × 10⁶ 细胞；因此，每个培养瓶需要一个冻存管。
9. 在37 °C水浴中解冻一管细胞，每10秒轻轻颠倒管子一次，持续约1分钟，直至冰完全融化且管内内容物呈完全液态。切勿将整支管子浸入水中，以避免潜在污染。
10. 在生物安全柜中，使用P1000微量移液器吸取解冻的细胞悬液，并逐滴加入步骤1.7中含10 mL DFHGPS的15 mL离心管中。为实现逐滴加入，应缓慢按压移液器推杆，使每次仅释放一至两滴。同时轻轻旋转15 mL离心管，以实现快速混匀。
11. 将细胞悬液在室温下以200 × g离心5分钟。弃去上清液，注意保留细胞沉淀。
12. 在步骤1.11中，取出步骤1.7中剩余的含有10 mL溶液的50 mL离心管。离心后，将细胞沉淀重悬于10 mL DFHGPS中，并在室温下以200 × g再次离心5分钟。
13. 在最后一次离心过程中，按照以下步骤准备新的培养基 表1 向步骤1.4中的10 mL DFHGPS培养基中添加生长因子（表1在生物安全柜（BSC）中操作。将含有生长因子的新鲜培养基置于生物安全柜中，待用时取出。
14. 从步骤1.2中取出T75培养瓶，用抽吸法弃去覆盖瓶底的条件培养基。然后使用血清移液管将步骤1.6中获得的5 mL条件培养基加入培养瓶中。注意避免刮伤瓶底。
15. 从离心机中取出细胞管，用吸液法弃去上清液，保留细胞沉淀。
16. 用5 mL移液管将细胞沉淀重悬于10 mL来自步骤1.13的新培养基中，上下吹打数次。将悬液加入步骤1.14中已包被的T75培养瓶中。用剩余的5 mL培养基冲洗盛有细胞沉淀的离心管，然后将此冲洗液也加入培养瓶中。
17. 轻轻前后摇晃T75培养瓶3次，确保细胞在瓶内均匀分布。确保培养瓶的瓶盖松开，以保证空气流通。在光学显微镜下观察细胞，做好记录，并在条件允许时拍照。
    注意： 细胞应呈半透明且为球形。若发现细胞颜色变深、不透明或边界不对称，应予以记录，因为这可能表明细胞死亡。同时注意观察是否存在真菌或细菌污染，例如培养基颜色变为黄色。
18. 将细胞培养瓶置于37 °C、含8.5% CO₂的培养箱中₂.
    注意： 使用8.5%而非5.0%的CO₂₂ 以维持该无血清培养基的 pH 值在 7.1–7.4 范围内。

2. hNSC 培养基更换

注意：每 3-4 天更换一次培养基。

1. 开启生物安全柜，用70%乙醇彻底清洁，并在光学显微镜下观察细胞。
   注意：记录细胞形态及神经球大小。复苏或传代后三天，细胞会聚集并开始形成非贴壁的神经球。
   注意：若细胞贴附于培养瓶底部，则需弃去该培养物，因为细胞贴壁会促进过早分化，导致细胞无法维持干细胞状态。若培养瓶中细胞过多，可能形成过大的球体（直径大于2 mm），此时球体中心的细胞因无法接触到培养基中的生长因子而开始分化。若观察到直径大于1 mm的球体，可进行传代（步骤3.1–3.22）。
2. 执行步骤1.4和1.5，并准备10 mL新鲜培养基（见步骤1.13）。
3. 将培养瓶倾斜至一侧，使神经球沉降至瓶底。
4. 使用5 mL血清移液管从混合培养基上层吸取5 mL条件培养基，注意避免吸入任何神经球。将这5 mL条件培养基转移至一个洁净的15 mL离心管中。
5. 再次小心避开神经球，从培养瓶中额外移除5 mL条件培养基，并将其加入同一个15 mL离心管中。
6. 将步骤2.2中准备的10 mL新鲜培养基加入培养瓶中剩余的5 mL条件培养基和细胞中。将培养瓶平放，置于光学显微镜下观察细胞状态。
7. 若在收集条件培养基过程中疑似吸入了细胞，需将条件培养基在室温下以100 × g离心5分钟。用1 mL条件培养基重悬沉淀中的细胞，然后将其加回培养瓶中。
8. 将步骤2.5/2.6中未使用的10 mL条件培养基置于15 mL螺口离心管中，于4 ˚C保存。
9. 重复步骤1.17/1.18。

3. hNSC 传代

1. 若将神经干细胞扩增至新培养瓶中，需确保所有新培养瓶均按照步骤1.2进行包被。
2. 按照步骤2.1清洁生物安全柜，并执行步骤1.4和1.5。
3. 按照步骤1.13制备培养基。每个T75培养瓶需要10 mL培养基。对于多个T75培养瓶，将10 mL培养基乘以培养瓶数量。
4. 准备1 mL或3 mL的Dulbecco磷酸盐缓冲液（dPBS）并加入葡萄糖，置于37 °C水浴中预热10分钟（用于胰蛋白酶溶液），具体体积根据下表确定 表2此时不要添加胰蛋白酶或DNase。由于机械或化学细胞解离可能导致死细胞释放DNA，可能需要使用DNase降解DNA。
   注意：对于培养9-10天后传代的一个T75培养瓶，细胞数量约为30 × 10⁶ 细胞，如果 5 × 10⁶ 最初接种于培养瓶中。通常，每 10 × 10⁶ 细胞。因此，传代培养9-10天后的T75培养瓶需要3 mL的dPBS溶液。
5. 将洁净的小型称量皿和血细胞计数板放入生物安全柜中，用70%乙醇擦拭，于生物安全柜中静置晾干约5分钟。
   注意： 称量船将在步骤 3.17.1 中使用。
6. 从培养箱中取出待传代细胞的培养瓶，并转移至生物安全柜中。轻轻倾斜培养瓶，使细胞沉降到聚集的培养基底部。培养瓶中约有15 mL培养基。
7. 以5 mL为一份，移除约10 mL培养基（即 5 mL + 5 mL）。将此10 mL培养基转移至一个洁净的15 mL离心管中，标记为“CM”（conditioned medium，条件培养基）。注意勿吸出培养瓶中剩余5 mL培养基内已沉降的细胞；这些细胞及其5 mL培养基将用于步骤3.8。
   1. 从步骤3.7中的“CM”管中取出3 mL条件培养基，转移至一个标记为“trypsin inhibitor solution”的15 mL离心管中，用于步骤3.12。取出3 mL后，“CM”管中剩余7 mL条件培养基，将“CM”管置于一旁，待步骤3.9使用。
8. 移除T75培养瓶中剩余的5 mL培养基和细胞，放入已标记为“Cells”的洁净15 mL离心管中。
9. 取步骤3.7.1中含7 mL条件培养基的“CM”管，用5 mL血清移液管分别以3.5 mL条件培养基洗涤T75培养瓶底部两次。每次洗涤后，将3.5 mL洗涤液转移至“Cells”管中。此步骤的目的是将T75培养瓶中所有神经球（细胞）完全移出。
10. 将“Cells”管在室温下以100 × g离心5分钟。离心期间，从37 °C水浴中取出dPBS/葡萄糖溶液，并根据相应比例加入适量的胰蛋白酶和DNase 表2.
11. “细胞”管停止离心后，移除所有条件培养基上清液，并转移至“CM”管。
12. 从步骤 3.7.1 中取出标有“trypsin inhibitor solution”的试管，并加入步骤中指定体积的胰蛋白酶抑制剂 表3使用与胰蛋白酶溶液相同体积的胰蛋白酶抑制剂溶液。
13. 将胰蛋白酶抑制剂溶液置于37 °C水浴中预热，备用。
14. 向15 mL离心管中的细胞沉淀加入胰蛋白酶溶液，用5 mL移液器吹打5-10次。盖紧管盖，置于37 °C水浴中孵育5 min。5 min后取出细胞，再次吹打5-10次，然后继续在37 °C水浴中孵育10-15 min。
15. 在最后5分钟内，将胰蛋白酶抑制剂溶液转移至生物安全柜中。
16. 在完成步骤2.14后收集细胞，上下吹打细胞直至球体完全解离（20–30次）。随后立即加入胰蛋白酶抑制剂溶液，并上下吹打10次。此解离后的细胞与胰蛋白酶抑制剂的混合液称为“细胞悬液”。
17. 按照以下步骤计数细胞悬液中的细胞数量。
    1. 将15 µL台盼蓝预混液（含5 µL 0.4%台盼蓝和10 µL dPBS）移入小型称量舟中，然后加入5 µL细胞悬液。上下吹打3–5次以混匀。随后，将10 µL台盼蓝/细胞悬液分别加入已覆盖盖玻片的血细胞计数板两侧。
    2. 在光学显微镜下观察细胞，计数四个角落方格中的细胞总数，并将这些数值相加。
18. 重复计数另一侧，并将两侧结果取平均值。
19. 将该数值乘以10,000，得到每毫升细胞悬液中的总细胞数。再将该数值乘以细胞悬液的总体积（毫升），计算出细胞悬液中的总细胞数。计算每瓶T75培养瓶接种500万细胞所需的细胞悬液体积。
    注意： 通常情况下，培养9-10天后，一个T75培养瓶将含有25-30 × 10⁶个细胞。因此，若将所有细胞传代至新的培养瓶中，共需要5-6个培养瓶。
20. 加入步骤 3.19 中计算出的细胞悬液体积至每个 T75 培养瓶，使细胞密度达到 5 × 10⁶ 每瓶细胞。如果体积少于5 mL，需添加额外的条件培养基，使总体积达到5 mL。然后加入含有生长因子的10 mL新鲜DFHGFPS培养基（表1) 加入烧瓶中。
21. 重复步骤 1.17 和 1.18，确保培养瓶上标注细胞类型、日期、培养瓶中的细胞数量以及传代次数（即细胞传代的次数）。然后进入步骤 4。
22. 如有需要，将额外细胞以最高达 30 × 10⁶ 个细胞/瓶的密度接种至一个 T75 培养瓶中。⁶ 每瓶培养瓶中加入细胞，过夜培养，然后按照步骤4的方法进行冻存。

4. hNSC 的冻存与保存

1. 传代后的第二天，从培养箱中取出用于冻存的细胞培养瓶（来自步骤 3.19 和 3.22）。倾斜培养瓶，将全部培养基和细胞转移至 15 mL 离心管中，然后在 216 × g 条件下离心 5 分钟。
2. 在离心过程中，配制冻存液（表 4）。每 5 × 10⁶ 个细胞准备 1 mL 冻存液。细胞数量在步骤 3.19 中已确定，即每瓶接种的细胞数，该数量在过夜培养后不会发生变化。
3. 准备冻存管，并贴上标注细胞名称、传代数、细胞数量、姓名缩写和日期的标签。离心结束后，用移液器吸除上清液，将细胞沉淀重悬于冻存液中，使细胞浓度为 5 × 10⁶ 个/mL。使用 5 mL 移液器，每管分装 1 mL（每管含 5 × 10⁶ 个细胞），并 tightly 密封。
4. 将冻存管放入含有 250 mL 异丙醇的冻存盒中（异丙醇最多可重复使用 5 次，之后需更换）。于 -80 °C 冰箱中过夜保存，随后转移至液氮罐储存系统中长期保存。

5. 铺板贴壁型人神经干细胞用于验证

1. 传代前一天（步骤 3.1–3.22），按照步骤 2.2 清洁生物安全柜，并准备一个 24 孔板和无菌的 12 mm 玻璃盖玻片。
2. 使用镊子将单个盖玻片放置于板中每个孔的底部。
3. 用无菌水中配制的 0.01% 多聚-D-赖氨酸（PDL）对含有盖玻片的孔进行包被，于 37 ˚C 孵育 1 小时。对于 24 孔板，每孔使用 250 μL PDL。
4. 移除孔中的 PDL，然后用 1 µg/cm² 层粘连蛋白/dPBS（每孔 250 μL）进行包被。将板在 37 °C 过夜孵育。若次日不使用，可用封口膜包裹板的边缘进行密封，并于 4 °C 保存。
   注意：若用封口膜密封且盖玻片未干燥，包被有层粘连蛋白的板可保存长达 2 周。
5. 按照步骤 3.1–3.22 所述方法传代细胞，然后确定接种到包被有盖玻片的 24 孔板中的细胞数量。
6. 通过抽吸去除孔中多余的层粘连蛋白溶液，并用 0.5 mL dPBS 冲洗一次。随后以每孔 0.6–1 × 10⁵ 个细胞/cm² 的密度将细胞接种至孔中。其余细胞按步骤 3.16–3.21 处理使用。
7. 在 24 孔板培养过程中的不同时间点，对细胞进行固定并染色，以检测多种干细胞标志物。

结果

表1：新型增殖培养基的生长因子。

...

一个 T75 培养瓶所需的 DFHGPS 培养基	10 mL
TPPS*	173 µL
200 mM L-谷氨酰胺	50 µL
10 mg/mL 胰岛素**	25 µL
20 µg/mL 表皮生长因子	10 µL

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	Gibco	11965-092
F12	Gibco	11765-054
葡萄糖（10%）	Sigma	G8644
HEPES（1 M）	Corning/cellgro	25-060-c1
青霉素-链霉素（100倍浓度）	Gibco	15140-122
胰岛素	Sigma	I4011
L-谷氨酰胺	Gibco	25030-081
转铁蛋白	Sigma	T2036
孕酮	Sigma	P8783
腐胺	Sigma	P5780
亚硒酸钠	Sigma	S5261
碱性成纤维细胞生长因子	R&D system	233-FB
表皮生长因子	R&D system	236-EG
白血病抑制因子	R&D system	7734-LF
层粘连蛋白	Invitrogen	23017-015
2.5% 胰蛋白酶	Gibco	15090-046
胰蛋白酶抑制剂	Sigma	T6522
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐（PDL）	Sigma	P6407-5MG
B-27 添加剂	Gibco/Invitrogen	17504-044
胎牛血清	Gibco	16000-044
二甲基亚砜	Sigma	D2650-100ml
杜氏磷酸盐缓冲液	Corning/cellgro	21-031-CV
牛血清白蛋白	Sigma	A4378-25G
CO2 培养箱	Thermo Forma	型号# 3110
离心机	Thermo Fisher Scientific	75004221
生物安全柜	Forma Scientific Ⅱ级 A/B3 型	型号# 1284
超低温冰箱（-80 °C）	Forma Scientific, Inc	型号# 8516
共聚焦显微镜	Nikon TE2000-E 显微镜配 C1si 共聚焦系统