利用人诱导性多能干细胞生成前脑型脑类器官

摘要

来源：Krefft, O. 等., 由人诱导多能干细胞生成标准化且可重复的前脑型脑类器官。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频概述了利用人诱导性多能干细胞（iPSCs）生成前脑类器官的过程，展示了从干细胞聚集体发育为模拟大脑皮层的复杂结构，并进一步分化为多种神经元类型的全过程。

方案

1. 诱导多能干细胞聚集体的生成

1. 从iPSC集落生成单细胞单层培养物
   1. 准备经基底膜提取物（BME）包被的6孔板。将BME在4 °C冰上解冻2-3小时，用预冷的Dulbecco改良Eagle培养基F12（DMEM-F12；1:50稀释）稀释，每孔加入1 mL稀释后的BME溶液覆盖孔底，于4 °C过夜孵育。
   2. 吸除培养基，用含0.5 mM EDTA的磷酸盐缓冲液（PBS）清洗至少两孔6孔板中的完整iPSC集落两次，随后在室温（RT）下用含0.5 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的PBS孵育4分钟。吸除EDTA溶液，用5 mL DMEM-F12培养基轻轻冲洗培养皿底部，使集落脱落。将细胞收集至15 mL离心管中，通过离心（室温下1,200 × g，4分钟）形成细胞沉淀。
      注意：已成功使用商业来源成纤维细胞重编程获得的iPSC。
   3. 吸除上清液，将iPSC集落与500 µL细胞解离试剂在37 °C孵育6分钟。
   4. 用1 mL移液器将细胞悬液轻轻吹打数次，使残留的细胞团块解离为单细胞。
   5. 向细胞悬液中加入4 mL DMEM-F12，以稀释细胞解离试剂。
   6. 在室温下以1,200 × g离心4分钟，沉淀细胞。
   7. 用2 mL含5 µM Y-27632的iPSC培养基重悬细胞，并接种至一个BME包被的6孔板孔中。
      注意：用于单细胞单层iPSC培养时，请使用材料表中指定的iPSC培养基。
   8. 次日更换为不含Y-27632的新鲜iPSC培养基。此后继续培养细胞，每天更换培养基，直至iPSC达到100%汇合。根据细胞系及起始孔的汇合度，此过程通常需要2-4天。
   9. 一旦细胞汇合，进行传代。吸除培养基，向细胞中加入500 µL细胞解离试剂。
   10. 在37 °C孵育5-10分钟，轻轻摇动培养板使细胞脱落。
   11. 用2 mL DMEM-F12冲洗细胞并收集至15 mL离心管中，再加入DMEM-F12至总体积为5 mL。
   12. 在室温下以1,200 × g离心4分钟，吸除上清液。
   13. 将细胞以1:2至1:4的比例接种至BME包被的6孔板中，每孔加入含5 µM Y-27632的iPSC培养基2 mL。
   14. 继续培养2-5天，每天更换不含Y-27632的iPSC培养基。待细胞再次汇合后，进行传代（步骤1.1.4-1.1.8）。
       注意：在用于生成iPSC聚集体前，需使用材料表中指定的iPSC培养基，将iPSC以单层形式连续传代至少两次，以使细胞适应培养条件。
2. 当单层iPSC培养物达到70-90%汇合时，用于生成iPSC聚集体。
   ​注意：已适应单细胞培养条件的iPSC在解离和聚集体形成过程中更不易受到导致细胞死亡的应激影响。单层iPSC培养物应呈现典型的多能性形态，无明显分化迹象。需定期检测培养物是否存在支原体污染。仅使用无支原体污染的iPSC培养物。
   1. 吸除6孔板中一孔的培养基，向细胞中加入500 µL细胞解离试剂。
   2. 在37 °C孵育5-10分钟，轻轻摇动培养板使细胞脱落。
   3. 用2 mL DMEM-F12冲洗细胞并收集至15 mL离心管中，再加入DMEM-F12至总体积为10 mL。
   4. 进行细胞计数时，取25 µL细胞悬液与25 µL台盼蓝混合以标记死细胞，使用计数板计数活细胞。
   5. 从细胞悬液中收集足够数量的细胞（每个iPSC聚集体需4,500个细胞）至15 mL离心管中。
   6. 在室温下以1,200 × g离心4分钟，吸除上清液。
   7. 用适量含50 µM Y-27632的iPSC培养基重悬细胞，使每150 µL含4,500个活细胞。
      注意：使用高浓度Y-27632（50 µM）对iPSC存活至关重要。
   8. 每孔加入150 µL细胞悬液至低吸附96孔U型底板中，置于37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育。
      注意：生成iPSC聚集体时，需考虑在第20天至少需要6个类器官用于质量控制（见第5节）。

2. 前部神经外胚层的诱导

1. 每天在组织培养显微镜下使用 4X 或 10X 物镜密切观察 iPSC 细胞团的形态变化。在第 1 天观察时，细胞团应具有清晰的边界。继续将 iPSC 细胞团在 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中培养。
   注意： 每孔中存在一定数量的死亡细胞属于正常现象，不会影响类器官的生成。
2. 从第 2 天开始，每隔一天换液一次，轻轻吸出约 2/3 的培养基，注意不要扰动底部的细胞团。补充 100 µL 不含 Y-27632 的 iPSC 培养基。
   注意： 在 4–6 天内，细胞团直径将达到 350–450 µm，并呈现光滑的边缘。
3. 在此阶段，使用剪去尖端的 100 µL 吸头将细胞团转移至低吸附性 6 cm 培养皿中（每皿最多 20 个细胞团），并加入皮质诱导培养基，其中包含 DMEM-F12、N2 补充剂（1:200）、B27 补充剂（1:100）、葡萄糖（0.2 mg/mL）、环磷酸腺苷（cAMP；0.15 µg/mL）、0.5% 非必需氨基酸（NEAA）、1% L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、肝素（10 µg/mL），以及化合物 LDN-193189（180 nM）、A83-01（500 nM）和 Wnt 信号抑制剂-1（IWR-1）（10 µg/mL）。细胞团转移至 6 cm 皿后，于 3 天后更换皮质诱导培养基进行换液。
4. 在皮质诱导过程中，使用 4X 物镜在组织培养显微镜下密切监测细胞团的形态变化。
   注意： 在皮质诱导培养基中培养 4–5 天后，细胞团边缘表面应开始变亮，表明神经外胚层分化启动。此时，可观察到假复层上皮的放射状结构形成。请进入第 3 节，将细胞团包埋于基底膜提取物（BME）基质中。

3. 神经外胚层聚集体在基质支架中的包埋

1. 在冰上于 4 °C 条件下解冻 BME 2–3 小时。取足量未稀释的 BME 分装。
2. 准备用于包埋的塑料石蜡膜片。使用无菌剪刀将塑料石蜡膜裁剪成 4 cm × 4 cm 的小片，将其覆盖在空的 100 µL 吸头盒（用于 100 µL 吸头）上，并用戴着手套的手指轻压，使塑料石蜡膜表面形成小凹陷（每个细胞聚集体需要 1 个凹陷）。用 70% 乙醇清洁塑料石蜡膜，并在密闭的无菌操作台内以紫外线照射 30 分钟（功率：15 瓦，波长：435 nm）。
3. 使用直径为1.5–2 mm的100 µL截短吸头，将每个细胞聚集体转移至塑料石蜡膜片的一个凹槽中。若两个细胞聚集体发生融合，则无需分离，应将其一同转移至同一凹槽内。
4. 使用未剪切的100 µL枪头轻轻吸除细胞聚集体周围的培养基。
   注意： 注意不要将细胞聚集体吸入枪头，以免损伤聚集体。
5. 向每个细胞团块中加入 40 µL 未稀释的 BME。
6. 使用未剪切的100 µL枪头将每个细胞聚集体置于BME液滴中央。
   注意： 务必小心，避免移液器吸头损伤正在发育的神经上皮。
7. 使用无菌镊子将塑料石蜡膜片小心转移至一个10 cm的培养皿（或其他合适的细胞培养皿）中，将培养皿放入培养箱内孵育15–20分钟，使BME凝固。
8. 同时，准备一个含有5 mL皮质诱导培养基的低吸附6 cm培养皿。
9. BME 聚合后，从塑料石蜡膜片上取下含有细胞聚集体的液滴。用无菌镊子将塑料石蜡膜翻转，轻轻挤压细胞聚集体，使其落入略微倾斜（约 30 °）的低吸附 6 cm 培养皿中，直至液滴完全脱离塑料石蜡膜片。每个 6 cm 培养皿中最多转移 16 个细胞聚集体。
10. 继续在37 °C下孵育细胞聚集体。

4. 由神经外胚层聚集体生成前脑型类器官

1. 在BME基质中包埋后一天，将类器官培养皿置于细胞培养摇床的摇床上，摇床倾斜角度为5°、转速为14 rpm，并放置于细胞培养箱中。
2. 每天观察类器官。在BME基质中包埋后，均一的神经上皮环状结构会逐渐形成。
3. 当可见神经上皮环状结构时，更换为类器官分化培养基，该培养基包含DMEM-F12、N2添加剂（1:200）、B27添加剂（1:100）、葡萄糖（0.2 mg/mL）、cAMP（0.15 µg/mL）、0.5% NEAA、1% L-丙氨酰-L-谷氨酰胺和胰岛素（2.5 µg/mL）。
4. 每3–4天更换一次类器官分化培养基，直至达到所需的分化时间点，随后固定类器官（见第5节）。
   注意：有时组织可能形成光学透明的芽状结构而无环状结构。尽管此情况并非理想状态，但并不影响皮层结构的发育。类器官可在类器官分化培养基中培养长达40天。对于更长时间的培养（40–100天），可在类器官分化培养基中添加1:50的BME以增加组织复杂性，并加入BDNF和GDNF以促进神经元的存活与成熟。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
A83-01	StemGent	130-106-274	500 nM
B27添加剂	Gibco	17504-044	1比100
基底膜提取物（例如Geltrex）	Gibco	A14132-02
环磷酸腺苷（cAMP）	Sigma-Aldrich	A9501	0.15 µg/mL
细胞解离试剂（TrypLE Express）	Gibco	12605028
计数室（例如Fuchs-Rosenthal）	Karl Hecht	40449001
D-葡萄糖	Carl Roth	HN06.3	0.2 mg/mL
DMEM-F12 L-谷氨酰胺	Gibco	11320033
包埋模具（Tissue-Tek Cryomold）	Sakura Finetek	4565
乙二胺四乙酸	Sigma-Aldrich	E6511	0.5 mM
明胶	Sigma-Aldrich	G1890
肝素	Sigma-Aldrich	H3149-25KU	10 ug/mL
WNT信号响应抑制剂（IWR-1）	Enzo Life Science	BML-WN103-0005	10 ug/mL
胰岛素	Sigma-Aldrich	91077C	2.5 µg/mL
L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（GlutaMax）	Gibco	35050038	1%
低吸附6 cm培养皿	Labomedic	2081646L
低吸附10 cm培养皿	Labomedic	2081646O
LDN-193189	Miltenyi Biotec	130-104-171	180 nM
N2添加剂	Gibco	17502-048	1比200
非必需氨基酸	Gibco	11140035	0.50%
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148	4.00%
磷酸盐缓冲液（PBS）	Gibco	14190144
塑料石蜡膜（Parafilm）	BRAND GMBH + CO KG	701606
ROCK抑制剂Y-27632	Cell Guidance Systems	SM02-100	5 µM 或 50 µM
蔗糖	Sigma-Aldrich	S7903
15 mL离心管	Corning Life Sciences	734-0451
显微镜载玻片（例如Superfrost Plus显微镜载玻片）	Thermo Scientific	4951PLUS4
组织培养6孔板	Falcon	734-0019
组织培养24孔板	Falcon	734-0949
台盼蓝染液	Gibco	15250-061
超低结合脂质涂层96孔板A-U96	Amsbio	AMS.51011610