利用人诱导性多能干细胞生成前脑型脑类器官

摘要

来源：Krefft, O. 等., 由人诱导多能干细胞生成标准化且可重复的前脑型脑类器官。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频概述了利用人诱导性多能干细胞（iPSCs）生成前脑类器官的过程，展示了从干细胞聚集体发育为模拟大脑皮层的复杂结构，并进一步分化为多种神经元类型的全过程。

方案

1. 诱导多能干细胞聚集体的生成

1. 从iPSC集落生成单细胞单层培养物
   1. 准备经基底膜提取物（BME）包被的6孔板。将BME在4 °C冰上解冻2-3小时，用预冷的Dulbecco改良Eagle培养基F12（DMEM-F12；1:50稀释）稀释，每孔加入1 mL稀释后的BME溶液覆盖孔底，于4 °C过夜孵育。
   2. 吸除培养基，用含0.5 mM EDTA的磷酸盐缓冲液（PBS）清洗至少两孔6孔板中的完整iPSC集落两次，随后在室温（RT）下用含0.5 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的PBS孵育4分钟。吸除EDTA溶液，用5 mL DMEM-F12培养基轻轻冲洗培养皿底部，使集落脱落。将细胞收集至15 mL离心管中，通过离心（室温下1,200 × g，4分钟）形成细胞沉淀。
      注意：已成功使用商业来源成纤维细胞重编程获得的iPSC。
   3. 吸除上清液，将iPSC集落与500 µL细胞解离试剂在37 °C孵育6分钟。
   4. 用1 mL移液器将细胞悬液轻轻吹打数次，使残留的细胞团块解离为单细胞。
   5. 向细胞悬液中加入4 mL DMEM-F12，以稀释细胞解离试剂。
   6. 在室温下以1,200 × g离心4分钟，沉淀细胞。
   7. 用2 mL含5 µM Y-27632的iPSC培养基重悬细....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
A83-01	StemGent	130-106-274	500 nM
B27添加剂	Gibco	17504-044	1比100
基底膜提取物（例如Geltrex）	Gibco	A14132-02
环磷酸腺苷（cAMP）	Sigma-Aldrich	A9501	0.15 µg/mL
细胞解离试剂（TrypLE Express）	Gibco	12605028
计数室（例如Fuchs-Rosenthal）	Karl Hecht	40449001
D-葡萄糖	Carl Roth	HN06.3	0.2 mg/mL
DMEM-F12 L-谷氨酰胺	Gibco	11320033
包埋模具（Tissue-Tek Cryomold）	Sakura Finetek	4565
乙二胺四乙酸	Sigma-Aldrich	E6511	0.5 mM
明胶	Sigma-Aldrich	G1890
肝素	Sigma-Aldrich	H3149-25KU	10 ug/mL
WNT信号响应抑制剂（IWR-1）	Enzo Life Science	BML-WN103-0005	10 ug/mL
胰岛素	Sigma-Aldrich	91077C	2.5 µg/mL
L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（GlutaMax）	Gibco	35050038	1%
低吸附6 cm培养皿	Labomedic	2081646L
低吸附10 cm培养皿	Labomedic	2081646O
LDN-193189	Miltenyi Biotec	130-104-171	180 nM
N2添加剂	Gibco	17502-048	1比200
非必需氨基酸	Gibco	11140035	0.50%
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148	4.00%
磷酸盐缓冲液（PBS）	Gibco	14190144
塑料石蜡膜（Parafilm）	BRAND GMBH + CO KG	701606
ROCK抑制剂Y-27632	Cell Guidance Systems	SM02-100	5 µM 或 50 µM
蔗糖	Sigma-Aldrich	S7903
15 mL离心管	Corning Life Sciences	734-0451
显微镜载玻片（例如Superfrost Plus显微镜载玻片）	Thermo Scientific	4951PLUS4
组织培养6孔板	Falcon	734-0019
组织培养24孔板	Falcon	734-0949
台盼蓝染液	Gibco	15250-061
超低结合脂质涂层96孔板A-U96	Amsbio	AMS.51011610