由诱导性多能干细胞生成脑微血管内皮细胞

摘要

来源：Endres, L. M.，等，利用诱导多能干细胞衍生的脑微血管内皮细胞建立Neisseria meningitidis感染模型。J. Vis. Exp. (2020)

本视频展示了一种诱导诱导性多能干细胞分化为脑内皮细胞的实验方案。

方案

1. 准备iPSC培养和BEC分化所需的材料。

1. 用于 IMR90-4 iPSC 培养的组织培养（TC）塑料表面基质包被
   1. 将基底膜基质凝胶（例如 Matrigel）分装为每份 2.5 mg，置于 -20 °C 保存。
      注意：处理基质凝胶时需迅速操作，并在冰上进行分装，因其在高于 4 °C 时会形成凝胶，一旦凝固则无法再分装。
   2. 进行 TC 塑料包被时，将一份基质凝胶迅速加入含 30 mL DMEM/F12 培养基的 50 mL 锥形管中。先向冷冻的基质凝胶中加入 1 mL 培养基，反复吹打至完全解冻，立即转移至含剩余培养基的 50 mL 锥形管中。
   3. 每孔 6 孔板使用 1 mL 该基质凝胶包被液，每瓶 T75 培养瓶使用 12 mL。
      注意：基质凝胶包被的 TC 塑料可在使用前最多两周制备。但必须避免包被液干燥，必要时可定期向孔内补充 DMEM/F12 培养基。
2. 在生物安全柜的无菌环境中，将 50 mL 的 50x 添加剂加入 450 mL 干细胞维持基础培养基中，配制干细胞维持培养基。
3. 配制 500 mL 未条件化培养基（UM）：将 392.5 mL DMEM/F12 与 100 mL 无血清替代物（KOSR）、5 mL 非必需氨基酸、L-谷氨酰胺（终浓度为 1 mM）以及 3.5 µL β-巯基乙醇混合。过滤除菌后，4 °C 保存，最多可保存 2 周。
4. 配制 200 mL 内皮细胞（EC）培养基并添加视黄酸（RA）和 bFGF：将 198 mL 人内皮细胞无血清培养基（hESFM）、2 mL 过滤除菌的贫小板血清衍生物（PDS）以及终浓度为 20 ng/mL 的 bFGF 混合。过滤除菌后，4 °C 保存，最多可保存 2 周。在加入细胞前，向 EC 培养基中添加终浓度为 10 μM 的 RA。
   注意：由于 PDS 已停产，供应可能受限，本方案已成功使用 B27 替代 PDS 完成。
5. 配制 200 mL 不含 RA 和 bFGF 的 EC 培养基：将 198 mL hESFM 与 2 mL 过滤除菌的 PDS 混合，过滤除菌后，4 °C 保存，最多可保存 4 周。

2. 人诱导多能干细胞向脑微血管内皮细胞的分化

1. iPSCs 分化用的铺板第-3天 分化方案的
   1. 每使用一个用于诱导分化的IMR90-4维持培养孔，吸除培养基，每孔加入1 mL酶解细胞解离试剂，在37 °C孵育7 min。
   2. 通过将1 mL解离后的细胞悬液转移至15 mL锥形管中，并加入至少2 mL新鲜干细胞维持培养基（每1 mL细胞悬液），以中和酶法细胞解离试剂的活性。在1,500 x g 5 分钟。
   3. 将细胞沉淀用 IMR90-4 细胞每孔 1 mL 的干细胞维持培养基重悬，并使用血细胞计数板对细胞进行计数。
      注意： 用0.4%台盼蓝按1:1比例稀释可能有助于在计数时区分活细胞与死细胞。根据iPSC的密度，一个6孔板中的单孔通常可获得1‒2 × 10⁶个细胞。⁶ 细胞
   4. 在T75培养瓶中进行分化时，加入7.5 × 10⁵个细胞⁵ 将细胞加入12 mL干细胞维持培养基和ROCK抑制剂（Y27632二盐酸盐），终浓度为10 µM。吸除T75培养瓶中的基质凝胶包被液，将细胞悬液转移至培养瓶中。通过前后左右轻摇培养瓶使细胞均匀分布，并于37 °C、5% CO₂条件下培养₂.
      注意： 在此步骤中添加ROCK抑制剂至关重要，可提高解离后单个干细胞的存活率。细胞应均匀分布在培养瓶中，并以单细胞形式呈现因ROCK抑制剂处理而产生的铺展状、类似间充质细胞的形态。
2. 开启 第-2天 和 第 -1 天更换为新鲜的干细胞维持培养基，每瓶T75加入12 mL。
3. 开启 第0天，通过更换培养基为UM启动分化；每T75培养瓶加入12 mL。
4. 每日更换UM第1天 – 第5天).
   注意： 细胞在UM培养基中通常经过2至3天达到汇合状态，肉眼或倒置明场显微镜下均可观察到。随着分化进程的推进，可见nestin+“神经样索状结构”，其间分布有PECAM-1+细胞。
5. 通过更换为含20 ng/mL bFGF和10 µM视黄酸（RA）的内皮细胞培养基，选择性扩增内皮细胞群体第6天）并孵育两天。含bFGF的EC培养基可提前两周配制。使用当天从冻存母液中加入RA（例如，每1 mL EC + bFGF中加入1 µL的10 mM RA母液）。
   注意： 不添加 RA 补充剂在第 6 天和第 8 天也可实现成功的分化。然而，省略 RA 将导致获得的胆管上皮细胞（BECs）的跨上皮电阻（TEER）降低。
6. 用胶原蛋白IV和纤连蛋白包被细胞培养板和膜插件（例如Transwell）第7天），用于BE细胞的纯化及后续实验。
   1. 用于膜插件的包被，将4份IV型胶原蛋白（1 mg/mL溶于0.5 mg/mL乙酸）、1份纤连蛋白（1 mg/mL）与5份无菌组织级水混合。包被细胞培养板时可将细胞外基质溶液按1:5稀释（即4份IV型胶原蛋白、1份纤连蛋白、45份水）。37 °C条件下用包被液孵育过夜。
      ​注意： 平板和膜插件也可在纯化步骤当天，于传代前至少包被4小时。
7. 通过在IV型胶原蛋白和纤维连接蛋白包被的培养板或膜插件上对已分化细胞进行传代培养来纯化BECs（第8天).
   1. 吸去内皮细胞培养基，加入消化解离试剂（每T75培养瓶12 mL），于37 °C孵育至约90%细胞从培养瓶表面脱落。
      注意： 细胞解离最多可能需要1小时。
   2. 孵育期间，从先前准备好的培养板/小室中移除胶原蛋白IV/纤连蛋白包被液，并在无菌操作台中让其干燥。小室干燥约需20分钟。
   3. 细胞脱落后，用10 mL移液管将细胞从培养瓶中冲洗下来。反复吹打以获得单细胞悬液。
      注意： 单细胞悬液对于可靠的细胞计数和形成致密的单层细胞至关重要。
   4. 用至少等体积的新鲜 hESFM 在 50 mL 一次性无菌聚丙烯离心管中稀释，并使用血细胞计数板进行细胞计数。
   5. 在1,500 × g离心10分钟以沉淀细胞。
   6. 用新鲜配制的 EC + bFGF + RA 重悬细胞，调整体积以获得 2 x 10⁶ 个细胞/mL 的悬液⁶ 细胞/mL，用于在膜插件上接种。加入 500 µL（1 × 10⁶ 细胞）接种于12孔插入式培养板上层，下层加入1.5 mL EC + bFGF + RA培养基。对于24孔和48孔板的接种，将细胞悬液按1:2稀释，分别加入500 µL（5 × 10⁵个细胞）和250 µL（2.5 × 10⁵个细胞）。⁵ 细胞/孔。将细胞均匀分布于孔/插件中，并在37 °C、5% CO₂条件下孵育₂.
8. 更换培养板/Transwell 中的培养基为 EC 培养基 无 bFGF 或 RA（第9天).

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Accutase (1x)	Sigma	A6964
全反式维甲酸（RA）	Sigma	R2625
β-巯基乙醇	Merck (Sigma-Aldrich)	805740
细胞培养板和培养瓶	Sarstedt
离心机（Heraeus Megafuge 1.0R）	Thermo Scientific
II级生物安全柜	Nuaire	NU-437-400E
二氧化碳培养箱（DHD Autoflow 二氧化碳气套式培养箱）	Nuaire
IV型胶原蛋白	Sigma	C5533
Costar Transwell 聚酯膜小室（12孔或24孔）	Corning	3460, 3470
纤连蛋白	Sigma	F1141
血细胞计数板（Neubauer）	A. Hartenstein	ZK06
人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）	PeproTech	100-18B
人内皮细胞无血清培养基（hESFM）	Gibco	11111-044
倒置显微镜（Wilovert）	Hund (Will Wetzlar)
iPS(IMR90)-4 细胞	WiCell
无血清替代物（KOSR）	Gibco	10828-028
L-谷氨酰胺（GlutaMAX）	Invitrogen	35050-038
Matrigel 基质	Corning	354230
非必需氨基酸（NEAA）	Gibco	11140-035
StemFlex 基础培养基 + 50x StemFlex 补充剂	Gibco	A3349401	干细胞维持培养基
水平转子（Heraeus #2704）	Thermo Scientific